溫度對厭氧環境下污泥中抗生素抗性基因行為特征的影響

錢燕云，鄭吉，徐莉柯，蘇超，陳紅

浙江大學環境與資源學院環境工程研究所，杭州 310058

溫度對厭氧環境下污泥中抗生素抗性基因行為特征的影響

錢燕云，鄭吉，徐莉柯，蘇超，陳紅*

浙江大學環境與資源學院環境工程研究所，杭州 310058

抗性基因的轉移傳播使得污水處理廠成為其重要的儲存庫，對人類健康存在潛在風險。實驗采用序批式厭氧反應器，溫度設定分別為15 ℃、中溫(30 ℃和36 ℃)、高溫(50 ℃和60 ℃)，探究溫度對污泥厭氧條件下8種抗生素去除效果的影響，以及四環素類抗性基因(tetA、tetG、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetW、tetX)、磺胺類抗性基因(sulI、sulII)和Ⅰ類整合子整合酶基因(intI1)的行為特征。研究發現溫度升高有利于抗生素及抗性基因的去除，15 ℃、中溫和高溫下總抗生素的平均去除率分別為45%、59%和78%；15 ℃、中溫和高溫下四環素類抗性基因分別削減0.52 log、0.90 log和1.50 log，磺胺類抗性基因分別削減0.56 log、0.78 log和1.31 log。相關性分析發現，總抗性基因與總氮、氨氮、SCOD(溶解性COD)均存在顯著相關性(R2=0.744、0.760、0.315，P<0.05)，而與總磷無顯著相關性(P>0.05)。intI1與總氮、氨氮、SCOD皆存在顯著相關性(R2=0.698、0.795、0.269，P<0.05)，而與總磷無顯著相關性(P>0.05)。說明微生物生長環境中的營養元素一定程度上影響著抗性基因的傳播和擴散。

抗生素；抗性基因；厭氧環境；溫度；序批式

20世紀以來，大量的抗生素被不合理、不規范地使用，其殘留給周圍環境中的細菌造成了一種選擇性壓力，使得篩選出的細菌耐藥性不斷增加，其中含有抗性的DNA片段是環境中抗性基因的重要來源[1]。醫用抗生素不能被人體吸收的部分可誘導腸道內的微生物產生耐藥性從而形成耐藥菌株，它們隨糞便排出體外，通過垂直基因轉移和水平基因轉移[2]等作用傳播抗性，使得抗性細菌大量增殖，而這些含有抗性細菌的污水最終排入城市污水處理廠，并在污水處理廠中傳播擴散，使得城市污水處理廠成為抗性基因和抗性細菌的儲存庫[3-5]。污水處理工藝并不能有效削減所有抗性細菌，其出水中仍含有一定豐度的抗性基因，排入自然水體給環境帶來了潛在威脅。Lapara等[6]對德魯斯海港、圣路易斯河中的抗性基因進行研究發現，城鎮污水處理廠經三級處理過的污水是其水體中抗性基因的重要來源，即使是處理過的污水，其排放仍對地表水中抗性基因豐度影響很大。目前，污水處理廠主要采用活性污泥法處理污水，會產生大量的剩余污泥，據國家環境保護部測算，我國城市每年污泥產生量預計將近3 000萬t(以含水率80%計)。這些污泥經填埋、露天堆放或土地利用后，其中的抗生素抗性基因會擴散傳播進入周圍環境和土壤中[7]。Munir等[8]研究發現污泥中含有高濃度的抗性基因和抗性細菌，高級污泥處理方法(厭氧消化和石灰石穩定)相比于傳統污泥處理方法(脫水和重力濃縮)能很大程度上降低抗性基因的豐度。相比于出水，剩余污泥經過農業和土地應用后，能夠釋放更多的抗性基因進入環境，給生態環境帶來更大的風險。

研究表明厭氧處理能有效削減污泥中的抗性基因。Ma等[9]研究了實驗室規模下不同污泥消化條件對磺胺類(sulI、sulII)，紅霉素類(ermB、ermF)，四環素類(tetO、tetW、tetC、tetG、tetX)抗性基因的影響，鑒于其作為預測抗性基因橫向轉移和多重耐藥性的指標，同時也檢測了Ⅰ類整合子基因(intI1)，研究表明固體停留時間延長，有利于大部分抗性基因(sulI、sulII、tetC、tetG、tetX)的削減，而小部分抗性基因(tetW、ermB、ermF)的豐度反而有所升高。Ghosh等[10]比較研究了高溫和中溫厭氧消化對不同機理的四環素類抗性基因(tetA、tetO、tetX)以及Ⅰ類整合子(intI1)的去除效果。目前，四環素抗性基因主要有3種機理[11]：(1)編碼“外排泵”(tetA、tetB、tetC、tetG、tetL)，利用膜轉運蛋白將細菌內的抗生素排出細胞或轉移到外周胞質內來降低抗生素濃度[12]。(2)編碼核糖體保護蛋白(tetM、tetW、tetO、tetQ)，這些存在于細胞質中的蛋白可以保護核糖體免受四環素作用。(3)編碼一種修飾或鈍化四環素的酶(tetX)，使四環素失活。研究表明，不同機理的四環素類抗性基因在厭氧消化過程中表現出不同的去除效率[10]。Diehl和Lapara[13]研究了實驗室規模下不同溫度(22 ℃、37 ℃、46 ℃、55 ℃)對抗性基因(tetA、tetL、tetO、tetW、tetX)以及Ⅰ類整合子基因(intI1)的影響，發現隨著溫度升高，ARGs的去除效果增加。以上研究均能證明污泥厭氧處理是削減污泥中抗性基因的有效方法。其中，溫度控制污泥中微生物的活性，是重要的影響因素[14]。但大部分的研究主要是連續或半連續狀態的厭氧處理[9-10,13]，溫度對序批式厭氧消化反應削減抗性基因影響的研究較少。

本研究采用序批式實驗，裝置規模為1 L，分別在15 ℃、中溫(30 ℃和36 ℃)、高溫(50 ℃和60 ℃)下反應50 d，過程中不添加任何物質，定期測定其中的總氮、總磷，SCOD(溶解性COD)、氨氮變化，以及3種抗性機理的四環素類抗性基因(tetA、tetG、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetW、tetX)，磺胺類抗性基因(sulI、sulII)。Ⅰ類整合子(intI1)廣泛存在于污泥中，可能影響抗性基因的水平轉移，因此也作為本實驗的目標基因之一。泥樣中測定的抗生素主要包括四環素(TC)、金霉素(CTC)、氧四環素(OTC)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、甲氧芐氨嘧啶(TMP)。根據測定結果，了解抗生素和抗性基因在厭氧反應中的行為特征和溫度對其削減的影響。同時分析其中氮磷營養元素與抗性基因以及intI1變化的相關性，探尋抗性基因在環境中傳播的潛在影響因素。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗裝置

本實驗采用序批式實驗，用1 L的三口圓底燒瓶為發酵罐，水浴恒溫磁力攪拌器(金壇市醫療儀器廠，中國)來控制發酵溫度，并達到全混狀態。實驗污泥來自臨安城市污水處理廠的剩余污泥，含水率為99%。實驗過程中，不添加任何物質，為了保證微生物對水的消耗，實驗開始時，加入少量去離子水。將該污泥分裝到5個1 L燒瓶中，用三腳架固定在水浴鍋中，燒瓶的一口通入盛有水的錐形瓶，觀察實驗過程中是否有氣泡產生。向污泥中通氮氣(高純，杭州今工特種氣體有限公司)5 min，除去燒瓶中的空氣并檢查氣密性。設定恒溫水浴鍋的溫度分別為15 ℃、30 ℃、36 ℃、50 ℃、60 ℃，用蠕動泵向水浴鍋中加水使得水浴鍋的水位線超過燒瓶中污泥的水位線，保證污泥的上下恒溫，觀察溫差在1 ℃以內。

1.2 樣品采集及預處理

每個溫度樣品各取15 mL，實驗進行50 d，對第0、10、15、20、30、40、50天樣品進行采樣分析。將采集的樣品先用大容量冷凍離心機(Thermo公司，德國)在10 000 r·min-1下冷凍離心10 min，上清液再用0.45 μm的濾膜進行抽濾。收集濾膜，將濾膜與泥樣放入物料盤于-20 ℃冰箱內預冷凍4～6 h后，使用真空冷凍干燥機(寧波新芝生物科技有限分公司，中國)進行凍干，將濾膜上的干污泥混入干燥的泥樣中，用研缽磨碎過篩(80目)后儲存備用。收集濾液，進行氮磷等的測定。

1.3 樣品水質指標的測定

將收集的濾液及時測定SCOD、總氮、總磷、氨氮。SCOD采用重鉻酸鉀消解法，用智能型多功能消解器(蘭州連華環保科技有限公司，中國)在150 ℃下消解2 h后，DR5000紫外可見分光光度計(北京安恒測試技術有限公司，中國)測定其吸光度，對照標準曲線得SCOD值。總氮測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ636—2012)。總磷測定采用鉬酸銨分光光度法(GB11893—89)。氨氮測定采用納氏試劑分光光度法(HJ 535—2009)。

1.4 超高液相色譜- 串聯質譜

本實驗采用超高液相色譜-串聯質譜聯用儀(UPLC-MS/MS)測定泥樣中8種抗生素(TC、CTC、OTC、SD、SMX、SM1、SM2、TMP)濃度[15]。樣品預處理，取0.08 g過篩(80目)后干污泥，采用震蕩-超聲-離心法萃取抗生素，用超純水稀釋至800 mL，使得甲醇含量在2%以下。經過稀釋后的提取液采用固相萃取方法進行進一步凈化提純。使用氮氣吹干儀(天津市東康科技有限公司，中國)吹至2 mL以下，用甲醇∶水(V∶V=1∶1)定容至5 mL。處理好的樣品密封避光儲存在-20 ℃，40 d內進行檢測，檢測前，添加內標物溶液。樣品的測定采用的超高壓液相色譜-質譜聯用儀為Waters Acquity TM Ultra Performance LC串聯Quattro Premier Micromass(Waters, USA)，色譜分析柱為Waters AcquityTM UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，電離源為電噴霧電離源(ESI)，檢測器為Quattro Premier Micromass，MRM檢測模式，Masslynx 4.0工作站(美國Waters公司)。為了比較完全的消除基質干擾效應，采用同位素內標法進行定量，通過檢測后內標物峰面積、待測物峰面積的比值，同時配置內標工作曲線，從內標物工作曲線中得到實際樣品的濃度。

1.5 定量PCR

本實驗使用FastDNA Spin Kit Forsoil試劑盒提取DNA，用微量蛋白質核算分析儀測定提取后所得樣品DNA的濃度和純度。試驗中選擇了四環素類抗性基因(tetA、tetG、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetW、tetX)、磺胺類抗性基因(sulI、sulII)、Ⅰ類整合子整合酶基因(intI1)以及16S rRNA進行檢測。定量PCR反應在StepOne Plus實時熒光定量PCR儀器(ABI，USA)中進行。反應體系為7.5 μL SYBR Premix Ex Taq溶液，0.3 μL ROX Reference溶液，0.3 μL濃度為10 μmol·L-1的正向引物，0.3 μL濃度為10 μmol·L-1的反向引物，4.6 μL ddH2O，2 μL DNA模板。定量PCR反應程序為預變性95 ℃下熱變性30 s；然后進入40個循環的擴增階段，包括95 ℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，延伸的同時掃描熒光信號。溶解曲線程序為55 ℃至95 ℃之間，每0.5 ℃讀數，其間停留30 s。每個樣品重復3次，根據每一輪擴增掃描到的信號強弱對比標準品的信號強弱得出樣品中抗性基因的濃度，反應結果也可以根據標準曲線計算出樣品中抗性基因的濃度。表1為本實驗中的引物和PCR條件。

表1 本實驗中的引物和PCR條件Table 1 Primer and PCR conditions used in this study

1.6 標準曲線建立

對臨安污水處理廠剩余污泥進行為期1個月的采樣，采樣頻率為每周1次。樣品使用專用DNA提取試劑盒進行DNA提取，普通PCR擴增得到目的基因，然后用商業化凝膠回收試劑盒進行純化回收，測定DNA含量、純度并調節至合適濃度后連接到pMD19-T載體，轉入E. coli感態細胞DH5α ，將感態細胞涂于含有氨芐青霉素，X-gal和IPTG的LB固體培養基上培養12～16 h，挑選陽性克隆子擴大培養后測序，測序結果同NCBI網站的BLAST進行序列同源性檢索比對(http://www.ncbi.nhn.nih.gov/blast/)。使用QIAGEN質粒專用提取試劑盒進行質粒提取，微量核酸蛋白質分析儀監測提取質粒的含量及純度，確保質粒DNA的A260/A280比值在1.8左右。符合要求的質粒，作為標準品計算濃度(質粒

濃度=(質量/分子量)×6.02×1023)。將已知濃度的質粒標準品依次進行10倍稀釋，并且保證質粒濃度在108～103之間，然后進行熒光定量PCR實驗，結果經StepOne Software(version 2.0)分析得到各抗性基因的熒光定量標準曲線。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 抗生素變化規律

原始污泥中均檢出上述8種抗生素，其中3種四環素類抗生素(TC、CTC、OTC)的檢出濃度較高，分別為1 185.3 μg·kg-1(干污泥)、1 003.2 μg·kg-1(干污泥)、2 639.1 μg·kg-1(干污泥)。磺胺類抗生素的檢出濃度較低，總濃度為910.8 μg·kg-1(干污泥)。相比于磺胺類抗生素，四環素類抗生素較易吸附于污泥顆粒上。抗生素的降解途徑主要是水解作用[21-22]。

圖1 不同溫度下厭氧環境污泥中抗生素的濃度變化

圖1為不同溫度下抗生素的變化趨勢，15 ℃、中溫(30 ℃、36 ℃)和高溫(50 ℃、60 ℃)下總抗生素的平均去除率分別為45%、59%和78%。其中四環素類抗生素的去除效果較好，15 ℃、中溫、高溫下的平均去除率分別為46%、60%和81%。磺胺類抗生素中SD、SM2和TMP的原始濃度較低但降解較多，SM1基本沒有降解，15 ℃、中溫、高溫下總磺胺類抗生素的平均去除率分別為41%、51%和59%。可以看出，抗生素的降解效果隨溫度的升高而升高。

2.2 抗性基因變化規律

原始污泥中均檢出8種四環素類目標抗性基因，其中tetG的濃度較高，達到1010copies·g-1(干污泥)，這與Auerbach等[4]的研究一致。圖2為不同溫度下四環素類抗性基因的變化趨勢，由圖可知溫度升高對四環素類抗性基因的削減效果影響顯著，15 ℃、中溫(30 ℃、36 ℃)和高溫(50 ℃、60 ℃)下分別削減0.52 log、0.90 log和1.50 log，但不同抗性機理的抗性基因表現不一致。編碼“外排泵”基因(tetA、tetG、tetL)中tetA和tetG的變化趨勢相似，相比于中溫，高溫下該類抗性基因(除tetL)的去除效果更佳，分別削減1.55 log和2.20 log。高溫對tetL的影響與其他基因不同，原因在于其主要存在于革蘭氏陽性菌，無論在厭氧還是好氧條件下，溫度升高對其的削減影響均不大[14]。4種編碼核糖體保護蛋白基因(tetM、tetW、tetO、tetQ)的變化趨勢相似，高溫均能促進其削減，且在40 d時削減量達到最大，分別為1.12 log、2.23 log、1.39 log和0.97 log。其中tetO的削減力度最大，原因在于這類抗性基因雖然來自相同作用機理，但是存在于不同種類的微生物，tetO主要存在于好氧微生物，厭氧環境促進其削減[13]。在反應進行到50 d時，只有高溫下的tetM、tetO和tetQ濃度部分回升，分別回升0.49 log、0.84 log和0.54 log。編碼鈍化酶基因tetX的變化趨勢與編碼核糖體保護蛋白基因相似，高溫下削減效果更佳，在40 d時削減量達到最大，15 ℃、中溫和高溫下分別為0.75 log、1.37 log和2.64 log。反應50 d時，各個溫度下的tetX濃度都有所回升，平均回升為0.33 log。 污泥中同樣檢出了2種磺胺類抗性基因(sulI、sulII)，且兩者濃度很高，分別為2.7×1010copies·g-1(干污泥)和1.3×1010copies·g-1(干污泥)。圖3為不同溫度下磺胺類抗性基因的變化趨勢，由圖可知溫度對磺胺類抗性基因影響顯著，15 ℃、中溫和高溫下分別削減0.56 log、0.78 log和1.31 log。sulI和sulII的表現一致，高溫均能促進其削減，在反應40 d時削減量最大，分別為1.07 log和1.86 log，sulII比sulI削減力度更大。但反應50 d時，各個溫度下的sulI和sulII都出現了少量回升，sulI平均回升0.18 log，sulII平均回升0.07 log。

圖3 不同溫度下厭氧環境污泥中磺胺類抗性基因的變化趨勢

圖4 不同溫度下厭氧環境污泥中I類整合子的變化趨勢

Ⅰ類整合子(intI1)是允許細菌結合外生基因盒并調節其表達的基因片段，對大部分抗性基因的交流和整合起重要作用[23]。圖4為不同溫度下污泥中intI1的變化趨勢，15 ℃、中溫和高溫下分別削減0.50 log、0.99 log和1.93 log。但反應50 d時各個溫度下平均回升0.15 log，這與磺胺類抗性基因實驗結果相似。目前研究表明高溫對Ⅰ類整合子具有一定的去除效果[9-10,13]，與本實驗結果一致。

污泥中細胞外的DNA會被水解和生物降解，其降解速率隨溫度的升高而升高，胞外DNA中含有一定數量的抗性基因，因此高溫相對于中溫對胞外抗性基因的去除更有效。除此之外，溫度影響著微生物體內的酶活性，改變酶促反應速率，最終影響細胞合成。溫度升高，微生物生長繁殖可能受限制，微生物種類數量也會有差異。污泥中微生物多樣性豐富，高密度的生物量是橫向基因轉移的先決條件[24]，因此其中的抗性基因可能通過橫向基因轉移而擴增，但也有部分抗性基因可能由于特異性而衰減，目前還沒有定論。本研究中溫度升高，有利于抗性基因的削減，這結論也在Ma等[9]的研究中得到印證。其變性梯度凝膠電泳(DGGE)結果顯示高溫下污泥中生物的多樣性比中溫下要低，而低多樣性減少了微生物通過橫向基因轉移找到合適宿主的可能性。生物群落的組成也能很大程度上影響抗性基因對環境變化的響應。反應50 d時部分抗性基因有所回升，可能是因為適應環境的微生物增殖而促進縱向基因轉移，或者是因為Ⅰ類整合子的同樣回升而引起的橫向基因轉移。

2.3 相關性分析

微生物生長與所在環境有密切關系，微生物所需的氮磷營養元素一定程度上也影響著微生物的生長。本實驗定期取樣，測其中的總氮(TN)、總磷(TP)、氨氮(NH3-N)和SCOD濃度，圖5為其在不同溫度下的變化趨勢，TP和SCOD濃度在15 ℃和中溫下呈下降趨勢，高溫下變化幅度很小但濃度較高。NH3-N和TN濃度在各個溫度下均呈上升趨勢，高溫下濃度也相對較高。

相關性分析結果見表2，星號標注表示兩者顯著相關(P<0.05)。由表可知，總抗性基因豐度與TN、NH3-N和SCOD皆存在顯著相關性，其中與TN和NH3-N的相關性系數較高(R2=0.745、0.760，P<0.01)。所有的抗性基因與TN、NH3-N均存在相關性，其中tetA與這兩者的相關性系數最高(R2=0.839、0.809，P<0.01)。所有的抗性基因與TP都不存在顯著相關性。大部分抗性基因與SCOD皆存在顯著相關性(P<0.05)。微生物細胞中大約含氮5%～13%，是微生物細胞蛋白質和核酸的主要成分，同時氮源也能提供部分能量供微生物生長，因此在外界不提供氮源的情況下氨氮等氮源物質對微生物的行為影響很大，微生物對氮源的需求量也大，從而在一定程度上影響了抗性基因的擴增、削減和轉移。磷等無機鹽參與細胞結構組成，并與能量轉移、細胞透性調節功能有關，微生物對其的需求量在10-4～10-3mol·L-1，本實驗測得磷的濃度均大于10-3mol·L-1，因此該厭氧反應過程中磷濃度變化對微生物的影響較小。

此外，研究還發現Ⅰ類整合子(intI1)與TN、NH3-N和SCOD皆存在顯著相關性(P<0.05)，其中與TN和NH3-N的相關性系數較高(R2=0.698、0.795，P<0.01)，這與總抗性基因表現一致。intI1對細菌間的基因轉移起重要作用，營養元素與其相關性顯著說明營養元素一定程度上也影響著抗性基因的橫向轉移，但抗性基因的傳播機制復雜，仍需進一步探究。

圖5 不同溫度下厭氧環境污泥TN、TP、NH3-N和SCOD的變化趨勢

表2 抗性基因與SCOD、NH3-N、TN、TP的相關性分析Table 2 Correlation analysis of ARGs and SCOD, NH3-N, TN and TP

注：*表示兩者具有顯著相關性(P<0.05)。

Note: Asterisk means there was a significant correlation of ARGs and SCOD, NH3-N, TN and TP.

[1] Tello A, Telfer T C. Selective pressure of antibiotic pollution on bacteria of importance to public health [J]. Environmental Health Perspectives, 2012, 120(8): 1100-1106

[2] Stokes H W, Gillings M R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens [J]. FEMS Microbiology Reviews, 2011, 35(5): 790-819

[3] Bouki C, Venieri D, Diamadopoulos E. Detection and fate of antibiotic resistant bacteria in wastewater treatment plants: A review [J]. Ecotoxicology & Environmental Safety, 2013, 91(4): 1-9

[4] Auerbach E A, Seyfried E E, Mcmahon K D. Tetracycline resistance genes in activated sludge wastewater treatment plants [J]. Proceedings of the Water Environment Federation, 2007, 41(5): 1143-1151

[5] Zhang Y, Marrs C F, Simon C, et al. Wastewater treatment contributes to selective increase of antibiotic resistance among Acinetobacter spp [J]. Science of the Total Environment, 2009, 407(12): 3702-3706

[6] Lapara T M, Burch T R, Mcnamara P J, et al. Tertiary-treated municipal wastewater is a significant point source of antibiotic resistance genes into Duluth-Superior Harbor [J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(22): 9543-9549

[7] Munir M, Xagoraraki I. Levels of antibiotic resistance genes in manure, biosolids, and fertilized soil [J]. Journal of Environmental Quality, 2011, 40(1): 248-255

[8] Munir M, Wong K, Xagoraraki I. Release of antibiotic resistant bacteria and genes in the effluent and biosolids of five wastewater utilities in Michigan [J]. Water Research, 2011, 45(2): 681-693

[9] Yanjun M, Christopher A W, John T N, et al. Effect of various sludge digestion conditions on sulfonamide, macrolide, and tetracycline resistance genes and class I integrons [J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(18): 7855-7861

[10] Ghosh S, Ramsden S J, Lapara T M. The role of anaerobic digestion in controlling the release of tetracycline resistance genes and class 1 integrons from municipal wastewater treatment plants [J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2009, 84(4): 791-796

[11] Roberts M C. Update on acquired tetracycline resistance genes [J]. FEMS Microbiology Letters, 2005, 245(2): 195-203

[12] Martinez J L, Martínez S L, Hernez A, et al. Functional role of bacterial multidrug efflux pumps in microbial natural ecosystems [J]. FEMS Microbiology Reviews, 2009, 33(2): 430-449

[13] Diehl D L, Lapara T M. Effect of temperature on the fate of genes encoding tetracycline resistance and the integrase of class 1 integrons within anaerobic and aerobic digesters treating municipal wastewater solids [J]. Environmental Science & Technology, 2010, 44(23): 9128-9133

[14] Zábranská J, Dohányos M, Jenícek P, et al. Efficiency of autothermal thermophilic aerobic digestion and thermophilic anaerobic digestion of municipal wastewater sludge in removing Salmonella spp. and indicator bacteria [J]. Water Science & Technology, 2003, 47(3): 151-156

[15] 朱賽嫦, 王靜, 邵衛偉, 等. 超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測地表水中18種藥物與個人護理品的殘留量[J]. 色譜, 2013, 31(1): 15-21

Zhu S C, Wang J, Shao W W, et al. Simultaneous determination of 18 pharmaceuticals and personal care products in surface water by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(1): 15-21

[16] Ng L K, Martin I, Alfa M, et al. Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistant genes [J]. Molecular & Cellular Probes, 2001, 15(4): 209-215

[17] Aminov R I, Garrigues J N, Mackie R I. Molecular ecology of tetracycline resistance: Development and validation of primers for detection of tetracycline resistance genes encoding ribosomal protection proteins [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2001, 67(1): 22-32

[18] Luo Y, Mao D, Rysz M, et al. Trends in antibiotic resistance genes occurrence in the Haihe River, China [J]. Environmental Science & Technology, 2010, 44(19): 7220-7225

[19] Liu M M, Zhang Y, Yang M, et al. Abundance and distribution of tetracycline resistance genes and mobile elements in an oxytetracycline production wastewater treatment system [J]. Environmental Science & Technology, 2012, 46(14): 7551-7557

[20] Gaze W H, Zhang L, Abdouslam N A, et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment [J]. ISME Journal, 2011, 5(8): 1253-1261

[21] Joanne C C, Roderick I M, Satoshi K, et al. Fate and transport of antibiotic residues and antibiotic resistance genes following land application of manure waste [J]. Journal of Environmental Quality, 2009, 38: 1086-1108

[22] Kümmerer K, Al A. Biodegradability of some antibiotics, elimination of the genotoxicity and affection of wastewater bacteria in a simple test [J]. Chemosphere, 2000, 40(7): 701-710

[23] Mazel D. Integrons: Agents of bacterial evolution [J]. Nature Reviews Microbiology, 2006, 4(8): 608-620

[24] Snyder L, Champness W. Molecular Genetics of Bacteria [M]. Washington DC: ASM Press, 2007: 117-130

◆

Effect of Temperature on Antibiotic Resistance Genes Behavior During Anaerobic Treatment of Sludge

Qian Yanyun, Zheng Ji, Xu Like, Su Chao, Chen Hong*

Department of Environmental Engineering, College of Environmental and Resource Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

Received 11 October 2015 accepted 3 December 2015

Sewage treatment plant became the important storage depot of antibiotic resistance genes (ARGs) because of the transfer and spread of ARGs, which may bring the potential risk to human health. In this study, sequencing batch anaerobic digestion is the main experimental method. Operating temperatures of anaerobic condition were 15 ℃ , 30 ℃, 36 ℃, 50 ℃ and 60 ℃. In the process, liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was taken to analyze 8 kinds of antibiotics concentrations in the sludge samples. The abundances of tetracycline resistance genes (tetA, tetG, tetL, tetM, tetO, tetQ, tetW, tetX), sulfonamide resistance genes (sulI, sulII) and class 1 integron (intI1) were quantified by real-time polymerase chain reaction. The results showed that the degradation rate of antibiotics increased as the temperature increased. The average removal rates of total antibiotics under 15 ℃, mesophilic condition (30 ℃, 36 ℃) and thermophilic condition (50 ℃, 60 ℃) were 45%, 59% and 78%, respectively. The reductions of total tet genes under 15 ℃, mesophilic condition and thermophilic condition were 0.52 log, 0.90 log and 1.50 log, while for sul genes the reductions were 0.56 log, 0.78 log and 1.31 log, respectively. Correlation analysis showed, total resistance genes had positive correlations with TN, NH3-N and SCOD (R2=0.744, 0.760 and 0.315, P<0.05), while they had no correlations with TP (P>0.05). intI1 had positive correlations with TN, NH3-N and SCOD (R2=0.698, 0.795 and 0.269, P<0.05), while they had no correlations with TP (P>0.05). Nutrient elements in environment influenced the transfer and spread of ARGs in a degree.

antibiotics; antibiotic resistance genes; anaerobic; temperature; sequencing batch

國家重大水專項(2014ZX07101-012)；國家自然科學基金項目(21277117)

錢燕云(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為污染控制及資源化技術，E-mail: aileen@zju.edu.cn；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: chen_hong@zju.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897. 20151011001

2015-10-11錄用日期：2015-12-03

1673-5897(2015)5-056-10

X171.5

A

陳紅(1969—)，女，博士，教授，主要研究方向為污染控制及資源化技術和環境生物技術。

錢燕云, 鄭吉, 徐莉柯, 等. 溫度對厭氧環境下污泥中抗生素抗性基因行為特征的影響[J]. 生態毒理學報，2015, 10(5): 56-65

Qian Y Y, Zheng J, Xu L K, et al. Effect of temperature on antibiotic resistance genes behavior during anaerobic treatment of sludge [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 56-65 (in Chinese)