城市社區農貿市場空氣微生物及抗生素抗性基因研究

房文艷，高新磊，李繼，董玉芳，曹罡，邵明非,*，宋江玉

1． 哈爾濱工業大學深圳研究生院 深圳市水資源利用與環境污染控制重點實驗室，深圳 518055 2． 中石化寧波工程有限公司，寧波 315103 3． 鄭州大學綜合設計研究院有限公司，鄭州 450000

城市社區農貿市場空氣微生物及抗生素抗性基因研究

房文艷1，高新磊1，李繼1，董玉芳2，曹罡1，邵明非1,*，宋江玉3

1． 哈爾濱工業大學深圳研究生院 深圳市水資源利用與環境污染控制重點實驗室，深圳 518055 2． 中石化寧波工程有限公司，寧波 315103 3． 鄭州大學綜合設計研究院有限公司，鄭州 450000

社區農貿市場活禽交易區是城市重要的人畜交叉感染區域，區內高存量的微生物和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)可通過糞便、沖洗水、空氣等介質傳播擴散。而空氣介質中通過微生物氣溶膠形式的傳播途徑，因其隱秘性、持久性的特點而對社區居民健康構成嚴重威脅。本文研究了深圳市某典型社區農貿市場內空氣微生物及抗生素抗性基因。結果表明，活禽交易區可培養細菌濃度高達105CFU·m-3，遠高于一般室內區域(103CFU·m-3)，其中PM2.5精細顆粒物(0.65～3.3 μm)中所含菌量占總菌量42%以上；活禽交易區空氣介質中，抗生素抗性基因tetG、tetW、sul1和sul2檢出率達70%以上，其絕對濃度在 104～109copies·m-3之間；周邊環境空氣樣品中，隨著與活禽交易區距離的增加，空氣微生物及抗生素抗性基因含量呈顯著下降趨勢。結果表明，農貿市場活禽交易區是微生物和抗生素抗性基因的一個重要儲存庫，活禽交易區空氣會嚴重影響農貿市場及其外周邊空氣質量。

微生物氣溶膠；抗生素抗性基因；社區農貿市場

社區農貿市場活禽交易區是城市重要的人畜交叉感染區域。區內禽類密度大，空間狹小封閉，空氣流動性差，禽類可通過糞便排出細菌和病毒[1]，逸散進入空氣極易形成微生物氣溶膠，并且微生物氣溶膠可借助空氣介質傳輸和擴散[2]，其中含有的病原菌和抗生素抗性基因會帶來環境污染，給動物體和人類健康造成潛在威脅[3-4]。

針對微生物氣溶膠污染，研究者采用基于培養的方式在校園、養殖場、污水處理廠等場所進行了大量研究[5-7]。其中，鐘召兵和王寧[2]研究了養殖環境微生物的氣溶膠粒徑分布并評估了其健康危害，研究顯示雞舍每天約有6.1×105CFU氣載細菌可進入人和動物小支氣管并直接進入肺泡。隨著獸用抗生素在養殖業的廣泛應用，畜禽糞便[8]、畜禽養殖環境空氣介質[9]中廣泛存在的抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs，以下簡稱“抗性基因”)也日益受到關注[10]。Sapkota等[11]在養殖場空氣氣溶膠中檢測到抗性基因，所有篩選的具有多重抗性的菌株中均含有大環內酯類抗性基因ermA、ermB、ermC、ermF和mefA；Alison等[12]研究了養殖場空氣氣溶膠中四環素類ARGs和I類整合子基因，認為養殖場空氣是多重抗性的存儲庫。另有研究在養殖場空氣中檢出了四環素類ARGs(tetA、tetC、tetO、tetW等)[13-14]。

社區農貿市場活禽交易區為人禽頻繁接觸的區域，區內微生物和抗性基因污染問題不應忽視。目前國內僅有少量針對城市社區農貿市場空氣微生物污染狀況的研究[15]，而對農貿市場空氣介質抗性基因污染研究更是少見報道。為全面了解城市社區農貿市場空氣微生物和抗性基因污染狀況，本研究選取深圳市某典型城市社區農貿市場作為研究對象，采用基于培養的方法調查其細菌氣溶膠污染狀況；選用農貿市場內可能存在的四環素類(tetG、tetM)和磺胺類(sul1、sul2)共4種抗性基因，采用非基于培養的方法研究其在農貿市場及周邊環境的空氣污染狀況。本研究旨在闡明城市農貿市場空氣介質中微生物氣溶膠及抗性基因污染特征，并為政府部門制定農貿市場活禽區管理措施提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

選取深圳市南山區平山農貿市場作為典型城市社區級農貿市場，該市場占地600 m2，人流量日均650人次，活禽區活禽交易量日均200只?？諝鈽悠贩謩e采集自農貿市場活禽區、一般區域(蔬菜區、肉類區等)和市場外10 m、100 m和400 m處。并采集一般人流密集區(深圳市某醫院輸液區)、一般室內環境(大學實驗室)、醫療潔凈環境(深圳市某醫院新生兒科)的空氣樣本作為分析對照。

1.2 實驗方法

1.2.1 采樣方法

可培養的空氣微生物采用安德森六級撞擊式空氣微生物采樣儀(FA-1型，遼寧，遼陽市康潔儀器研究所)采集，各級捕獲粒子粒徑分布分別為0.65～1.1 μm、1.1～2.1 μm、2.1～3.3 μm、3.3～4.7 μm、4.7～7.0 μm、 >7.0 μm，選用LB固體培養基，采樣高度1.5 m，流量為28.3 L·min-1，采樣時間根據不同的環境采集1～10 min不等。采樣后及時置于37 ℃培養16 h，再在各級采樣皿上進行菌落計數。

空氣微生物樣品選用智能大流量TSP(PM10)采樣器(2031型，山東，青島嶗山應用技術)采集，使用230 mm×180 mm玻璃纖維膜，流量為1.05 m3·min-1，時間4～24 h，采樣結束后取采樣膜面積的1/8(約52 cm2)，采用Fast DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals)提取空氣樣品DNA。

1.2.2 抗生素抗性基因分析方法

分別選擇tetG和tetW兩種四環素抗性基因以及sul1和sul2兩種磺胺抗性基因進行分析：采用PCR技術檢測4種抗性基因在空氣樣品中的檢出率，采用qPCR技術定量4種抗性基因的濃度。

空氣樣品內抗性基因濃度定量方法采用公式con(ARGs) = A×B×C，con(ARGs)表示單位空氣抗性基因含量(copies·m-3)，其中A表示單位空氣細菌總數(cell·m-3)，將大流量采樣器采集的濾膜經DAPI染色后使用熒光顯微鏡計數定量獲得；B表示單位細菌平均DNA含量(4.23×10-6ng·cell-1)[16]；C表示單位DNA抗性基因含量(copies·ng-1DNA)，通過qPCR實驗可得到[17]。

2 結果(Results)

2.1 農貿市場及周邊環境空氣微生物污染特征

以空氣微生物清潔評價標準[18-19]作為參照(虛線所示)，農貿市場活禽區、市場內一般區域和市場外10 m、100 m、400 m處空氣中細菌濃度分布結果見圖1。

圖1 農貿市場內外各采樣點細菌濃度分布

從圖1中可看出，農貿市場內外部不同區域細菌濃度水平有較大差異。農貿市場內部活禽區細菌濃度最高，可達105CFU·m-3，高于農貿市場內一般區域(104CFU·m-3)，并高出一般人流密集區(深圳市某醫院輸液區)2個數量級(103CFU·m-3)。農貿市場內細菌濃度超出空氣微生物評價清潔標準1～2個數量級，同時在距市場10 m、100 m、400 m的農貿市場環境空氣中，細菌濃度隨離農貿市場距離的增加而降低。

由農貿市場內部及周邊環境細菌氣溶膠粒徑分布(圖2)可知，農貿市場活禽區空氣細菌氣溶膠粒徑多集中在2.1～7.0 μm范圍內，而市場內一般區域及市場周圍環境細菌氣溶膠粒徑主要分布在1.1～4.7 μm。各不同區域采樣點PM2.5(粒徑范圍為0.65 ～ 3.3 μm)(stage 4, stage 5, stage 6)精細顆粒物粒徑范圍內細菌氣溶膠濃度占全部濃度的比例依次為42.6%、58.2%、66.2%、60.2%、61.4%和57.9%。

圖2 農貿市場內部及周邊環境細菌氣溶膠粒徑分布

2.2 農貿市場及周邊環境抗性基因污染特征

農貿市場內部空氣細菌氣溶膠污染較市場外環境空氣嚴重，顯示出其作為微生物污染源的屬性。為更進一步研究農貿市場空氣介質抗性基因污染狀況，采用非基于培養的方式對抗性基因tetG、tetW、sul1、sul2污染進行定性定量分析。結果表明，在農貿市場及周邊環境所有采集的空氣樣品中4種抗性基因均有檢出，其中tetW的檢出率為71.4%，tetG、sul1和sul2的檢出率達到100%。各采樣點空氣樣品抗性基因的絕對定量結果如圖3所示。

圖3 農貿市場及周邊環境空氣介質抗生素抗性基因絕對濃度

由圖3可看出，在農貿市場及周邊環境的空氣樣品中，4種抗性基因的絕對含量在102～109copies·m-3范圍內。其中活禽區4種抗性基因的絕對含量顯著高于其余樣品；隨著與活禽區距離的增加，4種抗性基因的濃度均呈下降趨勢。

3 討論(Discussion)

城市社區農貿市場人員活動密集，活禽交易區內活禽成為微生物氣溶膠污染的重要源頭，國內外對農貿市場微生物氣溶膠和抗性基因污染狀況研究較少且較為局限。葉錦韶等[15]研究了廣州市部分菜市場空氣的微生物污染狀況，結果表明活禽區細菌總數(95～15 000 CFU/皿)明顯高于GB9670—1996《商場(店)、書店衛生標準》[18]中細菌總數的規定限值(75 CFU/皿)，且市場內空氣微生物以活禽區為中心向外擴散傳播。本研究結果顯示農貿市場活禽區細菌濃度為105CFU·m-3，高出中國科學院制定的空氣微生物評價標準[19-20]中的標準清潔水平(1.0×103CFU·m-3)2個數量級，達到極嚴重污染水平(4.5×104CFU·m-3)。同時細菌氣溶膠污染程度具有以活禽區為中心向外圍環境擴散的趨勢，在農貿市場外10 m處的污染水平(2.3×103CFU·m-3已基本接近清潔標準。這與葉錦韶等[15]的活禽區細菌氣溶膠污染的研究結果較為一致。這可能是因為農貿市場內活禽通過糞便及排泄物逸散形成微生物氣溶膠[21-22]，而市場內空氣流動性較差，導致細菌氣溶膠擴散慢、濃度高。在市場外，因空氣對流快，細菌氣溶膠逸散較快。對氣溶膠粒徑分布的研究結果顯示，農貿市場活禽區細菌氣溶膠較均勻分布在各級，其中PM2.5(粒徑范圍0.65～3.3 μm)細菌氣溶膠比例達42%，此粒徑范圍內的細菌氣溶膠可進入人體氣管與支氣管或直接進入肺泡，存在引起呼吸道感染的風險[6]。

本文對農貿市場及周邊環境空氣樣品中可能含有的四環素類(tetG、tetM)、磺胺類(sul1、sul2)ARGs進行定量研究，結果表明農貿市場內活禽區4種抗性基因污染最為嚴重，且4種抗性基因的絕對含量隨著離活禽區距離的增加逐漸遞減，其中tetG在活禽區濃度(7.07×109copies·m-3)最高，而市場內一般區域(7.45×103copies·m-3)濃度迅速降低。研究結果與Gibbs等[23]報道的結果一致，即距養殖場下風向距離增加，抗性細菌濃度降低。相較于一般室內環境(大學實驗室)空氣，農貿市場活禽區抗性基因污染嚴重，平均高于前者4～5個數量級，且有向外圍空間擴散的趨向，提示農貿市場活禽區是抗性基因一個重要的潛在儲存庫。

在對農貿市場及其周邊環境空氣微生物及抗性基因污染狀況的研究中發現，農貿市場的污染狀況較周邊環境嚴重，而活禽區是農貿市場內污染最為嚴重的區域。隨著與活禽區距離的增加，細菌氣溶膠及抗性基因污染狀況均呈現逐漸遞減的趨勢?？梢娹r貿市場活禽區是細菌氣溶膠和抗性基因的潛在儲存庫，影響農貿市場及周邊環境空氣質量。

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Investigation on Airborne Bacteria and Antibiotic Resistance Genes in Urban Community Farmers Market

Fang Wenyan1, Gao Xinlei1, Li Ji1, Dong Yufang2, Cao Gang1, Shao Mingfei1,*, Song Jiangyu3

1. Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen Key Laboratory of Water Resource Utilization and Environmental Pollution Control, Shenzhen 518055, China 2. Sinopec Ningbo Engineering Co. Ltd, Ningbo 315103, China 3. Zhengzhou University Multi-functional Design and Research Academy Limited Company, Zhengzhou 450000, China

Received 28 May 2015 accepted 24 August 2015

The live poultry trading zones in urban community farmers markets are important across-infection areas between human and animals, where large amounts of bacteria and antibiotics resistance genes (ARGs) can be spread by manure, rinse water and air. The dissemination through the microbial aerosol in air, due to the characteristics of concealment and persistence, poses a serious threat to public health. This paper studies the bacteria and ARGs in the ambient air of a typical urban community farmers market in Shenzhen. The results show that the concentration of culturable bacteria is up to 105CFU·m-3in the live poultry trading zone, which is much higher than that found in general indoor area (103CFU·m-3). The bacteria content in PM2.5account for above 42% of the total bacteria content. The positive detection rates of ARGs including tetG, tetW, sul1 and sul2 in the air of the live poultry trading zone are above 70% and the absolute ARGs concentrations range from 104to 109copies·m-3. The concentrations of airborne bacteria and ARGs in ambient air decrease significantly with the increase in distance from the live poultry trading zone, suggesting that the live poultry trading zone in urban community farmers market is an important reservoir for the bacteria and ARGs, which affects the air quality of the market and its surroundings seriously.

microbial aerosols; ARGs; urban community farmers market

環保公益性行業科研專項(201309031)；國家自然科學基金(31200104)；深圳市基礎研究計劃(JCYJ20120613154350967)

房文艷(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為環境管理，E-mail: fwyyouxiang@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: mfshao@hitsz.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150528007

2015-05-28錄用日期：2015-08-24

1673-5897(2015)5-095-05

X171.5

A

邵明非(1979-)，男，香港大學博士，助理教授，主要研究方向為基于宏基因組學的微生物生態研究；環境工程微生物技術；污染海域碳、硫、氮、磷地質化學循環及相關微生物過程；抗生素耐藥微生物及耐藥基因。

房文艷, 高新磊, 李繼, 等. 城市社區農貿市場空氣微生物及抗生素抗性基因研究[J]. 生態毒理學報，2015, 10(5): 95-99

Fang W Y, Gao X L, Li J, et al. Investigation on airborne bacteria and antibiotic resistance genes in urban community farmers market [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 95-99 (in Chinese)