三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生長階段的急性毒性比較

蔣金花，吳聲敢，陳江濱，吳長興，蔡磊明，趙學平

浙江省農業科學院農產品質量標準研究所 省部共建國家重點實驗室培育基地—浙江省植物有害生物防控重點實驗室 農業部農藥殘留檢測重點實驗室，杭州 310021

三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生長階段的急性毒性比較

蔣金花，吳聲敢，陳江濱，吳長興，蔡磊明，趙學平*

浙江省農業科學院農產品質量標準研究所 省部共建國家重點實驗室培育基地—浙江省植物有害生物防控重點實驗室 農業部農藥殘留檢測重點實驗室，杭州 310021

為探明三唑酮對魚類不同生長階段的毒性效應，以斑馬魚和稀有鮈鯽為測試生物，檢測了三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生長階段的急性毒性差異。研究發現，三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎為低毒，其96 h-LC50值分別為21.1 (14.4～31.0)和14.2 (9.65～20.9) mg·L-1；高濃度的三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎的孵化有明顯的抑制作用，染毒96 h后，23.7 mg·L-1三唑酮組斑馬魚胚胎的孵化率為4.17%，22.5 mg·L-1三唑酮組稀有鮈鯽胚胎的孵化率為33.3%。三唑酮對斑馬魚仔魚、幼魚和成魚為低毒，其96 h-LC50值分別為24.8、21.3、13.1 mg·L-1，三唑酮對稀有鮈鯽仔魚、幼魚和成魚為中毒，其96 h-LC50值分別為9.96、7.89、6.89 mg·L-1。因此，三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生長階段的毒性效應排序一致，毒性從高到低順序依次為：成魚>幼魚>仔魚。試驗結果表明，相對于斑馬魚，稀有鮈鯽對三唑酮的毒性作用更為敏感，三唑酮對稀有鮈鯽不同生長階段的毒性均高于斑馬魚相應生長階段的毒性。

三唑酮；斑馬魚；稀有鮈鯽；急性毒性

三唑酮是我國第一個商品化的三唑類殺菌劑，至今已有20多年的應用歷史。由于其對作物多種病原菌具有高效、內吸、廣譜的作用，而成為目前應用范圍廣、防治效果好、最具開發應用潛力的一類殺菌劑。三唑酮在農田施用后能夠向土壤深處遷移和擴散，通過雨水的淋溶作用進入水體造成水體污染，進而影響水生生物。研究發現，三唑酮對斑馬魚成魚96 h急性毒性為低毒，96 h-LC50值為13.8 (11.3～14.8) mg·L-1[1]，三唑酮可以造成斑馬魚胚胎畸形和眼睛發育不全[2]。隨著三唑類殺菌劑的使用量逐年增加，其造成的環境風險也越來越受到重視，目前，已有大量三唑類殺菌劑包括三唑酮對哺乳動物毒理研究的文獻報道，但三唑酮對水生生物不同生長階段的毒性效應的研究較少，因此研究三唑酮對不同水生生物的毒性效應對評價三唑酮的環境風險和安全使用具有重要意義。

農藥多數通過飄移或地下水滲漏進入水體造成水污染，魚類是水環境中的主要生物之一，魚類的生態毒理反應和變化可作為水環境評價的良好指標，因此以魚類為受試對象的毒性試驗在評價化學品環境效應方面起著重要作用。目前OECD、EPA、ISO等各國組織機構常用的生態毒性檢測魚種是斑馬魚(Danio rerio)，因其價格低廉、容易獲得、管理飼養易行等諸多因素受到許多環保組織或國家的重視，他們已經將化學品對其急/慢性毒性效應作為評價污染物對水生環境危害程度的指標。我國尚沒有建立起標準的實驗魚類，目前國內有能力提供生態毒性數據的實驗室采用的試驗用魚還局限于國際通用種，缺乏本土生物的生態毒性數據不但影響了對化學品安全性的全面評價，也難以滿足我國化學品管理的需要。2003年，我國頒布的《新化學物質環境管理辦法》[3]中明確規定：“新化學物質的生態毒理學數據必須包括在中國境內用中國的供試生物完成的測試數據”，稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)被推薦為我國化學品毒性測試生物之一。稀有鮈鯽具有性成熟快、易于飼養，在實驗室內可周年產卵、連續產卵等優點，20世紀90年代，中國科學院水生生物研究所就開始對其進行了基本生物學研究[4]。目前，中國科學院水生生物研究所、中國科學院生態環境研究中心等正利用稀有鮈鯽為試驗材料在“評價內分泌干擾物長期低劑量暴露影響的魚類實驗模型”、“環境內分泌干擾物的生物篩選”等方面開展工作。但作為一種新興實驗魚種來說，生態毒性數據還不全面，也沒有形成完善的檢測評價體系，目前關于化學品對稀有鮈鯽某一生長階段的急性毒性或者慢性毒性效應研究較多[5-9]，但對于稀有鮈鯽和斑馬魚不同生長階段的毒性差異研究還十分有限，為了更好的證實稀有鮈鯽是進行化學品毒性測試和環境水樣毒性實驗的模式生物，本研究以斑馬魚和稀有鮈鯽為供試生物模型，研究了三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生長階段的毒性效應，通過比較三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽的毒性差異，豐富稀有鮈鯽的毒性實驗數據庫，為稀有鮈鯽發展成為國際通用種提供理論數據支撐。試驗結果對進一步研究三唑酮的致毒機制具有一定的現實意義，也為評價三唑酮的安全使用提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：24孔細胞培養板和6孔細胞培養板均購自浙江拱東醫療科技有限公司，分別作為胚胎和仔魚染毒器具。

試劑：三唑酮原藥(97.1%)，江蘇鹽城利民農化有限公司；分析純吐溫-80，國藥集團化學試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，天津市福晨化學試劑廠。

1.2 實驗材料

稀有鮈鯽種魚購自江蘇無錫中科水質環境技術有限公司，斑馬魚種魚購自武漢中科院水生生物研究所的國家斑馬魚資源中心，AB型品系，本試驗所用斑馬魚和稀有鮈鯽的胚胎、仔魚、幼魚和成魚均系其繁殖所得。斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎分別為同一天收集的健康胚胎；仔魚為孵化后8日齡；幼魚為孵化后55日齡；成魚為3月齡。仔魚、幼魚和成魚均于正式試驗前24 h停止投餌。

試驗用水為曝氣除氯并經活性炭過濾的自來水，水溫為(25±1) ℃，pH控制在6.5～7.5，光/暗比為14 h/10 h，溶解氧≥5.8 mg·L-1。

1.3 試驗方法1.3.1 試驗藥液配制

三唑酮原藥用吐溫-80和DMF溶解，經超聲混勻定容后配制成一定濃度的標準儲備液，冷藏備用。試驗時，用移液器吸取適量儲備液加入定量的標準稀釋水，超聲混勻，按相應倍數逐級稀釋至設計濃度。試驗期間各試驗容器內助溶劑DMF在水中最終濃度均未超過0.100 mg·L-1。標準稀釋水按照《化學品魚類急性毒性試驗》[10]方法配制。

1.3.2 胚胎染毒試驗

參考世界經濟合作與發展組織(OECD)方法[11]，通過立體顯微鏡觀察，挑選發育正常的健康受精卵供試。采用24孔細胞培養板，每孔加入2 mL供試藥液并放入1枚受精卵。根據預備試驗結果，設定三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎毒性試驗濃度(表1)，按最高濃度組的助劑濃度設置助劑對照組，以稀釋水為空白對照組。每濃度設2次重復，每重復為1個24孔板。

染毒期間環境溫度為(25±1) ℃，光/暗比為14 h/10 h。每24 h更換1次溶液。試驗期間分別于6、24、48、72、96 h時間點觀察并記錄死亡數、孵化數及相關中毒癥狀，并及時取出死亡個體。

1.3.3 仔魚、幼魚和成魚試驗

根據OECD TG 203[12]方法，設計不同生長階段的斑馬魚和稀有鮈鯽急性毒性試驗。根據預備試驗結果，設定斑馬魚和稀有鮈鯽仔魚、幼魚和成魚的試驗濃度(表1)，按最高濃度組的助劑濃度設助劑對照組，以稀釋水為空白對照組。

試驗用水為曝氣除氯并經活性炭過濾的自來水。仔魚急性毒性試驗采用6孔板，每孔放入3條仔魚，設2次重復，每重復為1個6孔板；幼魚和成魚采用6 L魚缸，每缸15條魚，均設2次重復。仔魚、幼魚和成魚的試驗過程均采用“半靜態法” ，每24 h更換1次藥液。

表1 三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生長階段的急性毒性試驗濃度Table 1 The acute toxicity concentration of triadimefon to different life stages of zebrafish and rare minnow

試驗期間分別于6、24、48、72和96 h時間點觀察并記錄各組斑馬魚和稀有鮈鯽中毒癥狀及死亡情況，每隔24 h檢查1次各組的pH值及溶解氧含量，并及時清除死魚。

1.4 數據處理

用DPS數據處理系統(9.50標準版，浙江大學)計算斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎、仔魚、幼魚和成魚的LC50值及其95%置信區間，分析三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽各生長階段的毒性差異。

2 結果(Results)

2.1 三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎的毒性效應2.1.1 致死效應

圖1為斑馬魚胚胎經不同濃度三唑酮處理不同時間后的死亡率。最高試驗濃度80.0 mg·L-1三唑酮處理組24 h時胚胎的死亡率為29.2%，在48 h時死亡率已達100%；在24～96 h內，53.3、35.6、23.7、15.8、10.5、7.02 mg·L-1三唑酮處理組的胚胎死亡率

圖1 三唑酮對斑馬魚胚胎死亡率的影響

逐漸增加，96 h時死亡率分別為87.5%、58.3%、29.2%、 20.8%、8.30%、4.17%。相對于藥劑處理組，空白對照組和助劑對照組對斑馬魚胚胎的死亡率沒有影響。

圖2為稀有鮈鯽胚胎經不同濃度三唑酮處理不同時間后的死亡率。在24～96 h內，隨著暴露時間的延長，三唑酮各濃度處理組的胚胎死亡率逐漸增加，72 h后各處理組的死亡率顯著增加；在96 h時，4.44、6.67、10.0、15.0和22.5 mg·L-1試驗組的死亡率分別為0%、16.7%、27.8%、50.0%和83.3%。稀有鮈鯽孵化時間約為卵產出后72 h，因此72 h為其孵化出卵殼的關鍵時間，從圖2可見，72～96 h為三唑酮對稀有鮈鯽胚胎毒性作用最明顯的時間段。相對于藥劑處理組，空白對照組和助劑對照組對稀有鮈鯽胚胎的死亡率沒有影響。

結果表明，三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎的毒性隨處理濃度的增大而增加，同時隨暴露時間的延長而增加，顯示一定的劑量-效應和時間-效應關系。

圖2 三唑酮對稀有鮈鯽胚胎死亡率的影響

表2為96 h 時三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎的半致死濃度(LC50)及95%置信區間。從中可看出，三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎96 h-LC50值分別為21.1 (14.4～31.0)和14.2 (9.65～20.9) mg·L-1,因此稀有鮈鯽胚胎對三唑酮比較敏感，三唑酮對稀有鮈鯽胚胎的毒性高于斑馬魚胚胎。

2.1.2 亞致死效應

圖3為不同濃度三唑酮處理后斑馬魚胚胎孵化率的變化趨勢。在三唑酮作用下，斑馬魚胚胎孵化率隨著三唑酮濃度的增大而降低，高濃度的三唑酮對斑馬魚胚胎的孵化有明顯的抑制作用，35.6 mg·L-1的三唑酮可以完全抑制胚胎的孵化。染毒96 h后，23.7、15.8、10.5、7.02 mg·L-1的三唑酮對斑馬魚胚胎的孵化率分別為4.17%、50.0%、91.7%、91.7%。空白對照組和助劑對照組對斑馬魚胚胎的孵化率沒有影響。

圖4為不同濃度三唑酮處理后對稀有鮈鯽胚胎孵化的影響。稀有鮈鯽胚胎孵化的最早時間為染毒48 h后，22.5 mg·L-1的三唑酮對稀有鮈鯽胚胎的孵化有明顯的抑制作用，染毒72和96 h時，22.5 mg·L-1的三唑酮對稀有鮈鯽胚胎的孵化率分別為27.8%和33.3%。其余濃度(4.44～15.0 mg·L-1)對稀有鮈鯽胚胎孵化的影響與空白對照和助劑對照組相近。

試驗表明，高濃度的三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎的孵化都有一定程度的抑制作用。在相同培養條件下，三唑酮對斑馬魚胚胎孵化的影響高于對稀有鮈鯽胚胎孵化的影響。

2.2 三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽仔魚、幼魚和成魚的急性毒性

研究發現，隨著三唑酮濃度的增加，斑馬魚和稀有鮈鯽仔魚、幼魚和成魚的死亡率都出現逐漸上升的趨勢，說明三唑酮和毒性之間存在劑量-效應關系。試驗期間，經三唑酮染毒處理后，中毒癥狀隨濃度的提高而越發明顯。高濃度的三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽成魚的毒性作用比較明顯，染毒初期主要表現為快速游動，焦躁不安，隨著染毒時間的延長，魚游動變得遲緩，對外界刺激變得遲鈍，個別魚出現側翻失衡及沉底現象，最終死亡。三唑酮處理后，斑馬魚和稀有鮈鯽仔魚和幼魚的早期中毒癥狀不明顯，隨著染毒時間延長，個別魚體出現側翻，脊柱彎曲或者魚體變白腐爛等中毒癥狀。低濃度三唑酮處理組的斑馬魚和稀有鮈鯽無異常癥狀，與空白對照和助劑對照組基本相似。

圖3 三唑酮對斑馬魚胚胎孵化率的影響

表2 三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎的急性毒性 (96 h)Table 2 The acute toxicity of triadimefon to the embryo of zebrafish and rare minnow (96 h)

圖4 三唑酮對稀有鮈鯽胚胎孵化率的影響

三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽3個不同生長階段的急性毒性見表3，三唑酮對斑馬魚仔魚、幼魚和成魚的96 h-LC50值分別為24.8、21.3、13.1 mg·L-1，三唑酮對稀有鮈鯽仔魚、幼魚和成魚的96 h-LC50值分別為9.96、7.89、6.89 mg·L-1，因此，三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生命階段的毒性從高到低順序依次為：成魚>幼魚>仔魚。研究表明，稀有鮈鯽對三唑酮比較敏感，三唑酮對稀有鮈鯽不同生命階段的毒性均高于斑馬魚相應生長階段的毒性，與三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎的毒性結果一致。

3 討論(Discussion)

毒性研究是熱點問題，一般情況下，以一種魚類模式生物的急性毒性結果作為化學品的生態毒理學數據，可能會造成對本土生物的欠保護或過保護，也無法對化學品安全性作出全面的評價。本試驗分別以胚胎、8日齡仔魚、55日齡幼魚和3月齡成魚為研究樣本，以國際通用種斑馬魚和我國特有種稀有鮈鯽為測試生物，研究了三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生長階段的急性毒性影響。三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽的毒性影響涵蓋了魚類生長的整個生命周期，所得結果可以為三唑酮的毒性效應以及生態風險評價提供基礎數據。通過比較三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生長階段的毒性效應，豐富本土生物稀有鮈鯽的毒性實驗數據庫，以完善相關毒性效應研究的基礎數據，滿足我國化學品管理的需要，并為制定合理的測試導則提供參考，也為選擇更為合適的本土模式生物來評價不同化合物的毒性效應提供數據支撐。

在相同培養條件下，高濃度的三唑酮對斑馬魚胚胎的孵化有明顯的抑制作用，35.6 mg·L-1的三唑酮可以完全抑制胚胎的孵化，染毒96 h后，23.7 mg·L-1三唑酮組中斑馬魚胚胎孵化率為4.17%，22.5 mg·L-1三唑酮組中稀有鮈鯽胚胎的孵化率為33.3%。由此可見，三唑酮對斑馬魚胚胎的孵化影響高于對稀有鮈鯽胚胎孵化的影響。三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生長階段的急性毒性測定結果顯示，三唑酮對斑馬魚仔魚、幼魚和胚胎的毒性相當，96 h-LC50值分別為24.8、21.3和13.1 mg·L-1，斑馬魚成魚對三唑酮最為敏感，稀有鮈鯽不同生命階段對三唑酮毒性的敏感性從高到低順序依次為：胚胎>成魚>幼魚>仔魚(96 h-LC50值分別為14.2、9.96、7.89、6.89 mg·L-1)。根據國家環境保護局制定的《化學農藥環境安全評價試驗準則》[13]中將農藥對魚類的毒性等級劃分為4個等級：劇毒，LC50≤0.1 mg·L-1；高毒，0.110 mg·L-1，因此97.1%三唑酮原藥對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎、斑馬魚仔魚、幼魚和成魚的96 h急性毒性等級均為低毒，對稀有鮈鯽仔魚、幼魚和成魚的96 h急性毒性等級均為中毒。本研究表明，稀有鮈鯽對三唑酮的毒性作用更為敏感，因此，在研究三唑酮的毒性作用機制時，作為我國本土生物的稀有鮈鯽相對于斑馬魚更為適合。

表3 三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生長階段的急性毒性 (96 h)Table 3 The acute toxicity of triadimefon to different life stages of zebrafish and rare minnow (96 h)

歐盟(EU)和世界自然基金(WWF)把三唑酮列為具有生殖和內分泌干擾毒性的殺菌劑之一。三唑酮主要通過影響甾醇14-α脫甲基酶(CYP51)和芳香酶(CYP19)，從而影響類固醇生成，具有一定的擬雌激素活性[14]。研究發現，三唑酮對小鼠和斑馬魚胚胎發育過程中的類固醇合成途徑中關鍵元件的基因表達具有一定的調控作用[15-16]。同時，三唑酮對大鼠和人類肝臟細胞具有相同的毒性效應，可以調控雌雄激素代謝，脂肪酸以及固醇和類固醇代謝途徑相關基因的表達[17]。現有研究表明，三唑酮對不同的生物具有類似的毒性效應，但其具體的毒性機制還有待進一步研究。已有報道顯示，三唑酮對日本青鳉不同生命階段的毒性為仔魚>幼魚>成魚(96 h-LC50值分別為12.5、11.0、0.354 mg·L-1[18])，說明三唑酮對斑馬魚、稀有鮈鯽和日本青鳉不同生長階段的毒性差異大，三唑酮對日本青鳉不同生長階段的毒性均高于斑馬魚，日本青鳉成魚對三唑酮最為敏感。斑馬魚、日本青鳉和稀有鮈鯽不同生長階段對三唑酮敏感性差異的具體原因，應該從這3種生物的基因組差異來進一步研究，從分子和蛋白水平來研究三唑酮對斑馬魚、日本青鳉和稀有鮈鯽的胚胎毒性、致畸性、神經毒性以及內分泌干擾效應，進一步討論三唑酮的致毒機制。

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Acute Toxicity Effects of Triadimefon on Different Life Stages of Zebrafish (Daniorerio) and Chinese Rare Minnow (Gobiocyprisrarus)

Jiang Jinhua, Wu Shenggan, Chen Jiangbin, Wu Changxing, Cai Leiming, Zhao Xueping*

State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Key Laboratory for Pesticide Residue Detection of Ministry of Agriculture, Institute of Quality and Standard for Agro-Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China

Received 18 November 2014 accepted 30 December 2014

To explore the toxic effects of triadimefon on fish at different life stages, the differences in acute toxicity of triadimefon to zebrafish (Danio rerio) and Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) at different life stages were evaluated. The results showed that triadimefon was low toxic to the embryos of both zebrafish and rare minnow, and the 96 h-LC50value was 21.1 (14.4～31.0) and 14.2 (9.65～20.9) mg·L-1, respectively. An obvious inhibition of embryos hatching for both fish was observed after the exposure to high concentration of triadimefon for 96 h, and the hatching rate was 4.17% and 33.3%when the embryos of zebrafish and rare minnow were exposed to 23.7 and 22.5 mg·L-1triadimefon, respectively. Triadimefon exhibits low toxic to the larvae, juvenile, and adult of zebrafish with the 96 h-LC50values of 24.8, 21.3, and 13.1 mg·L-1respectively. Triadimefon shows moderately toxic to the larvae, juvenile, and adult of rare minnow with the 96 h-LC50values of 9.96, 7.89, and 6.89 mg·L-1. The trend of triadimefon acute toxicity to zebrafish and rare minnow at different life stages was the same: adult>juvenile>larva, and rare minnow was more sensitive to triadimefon during different life stages compared with zebrafish.

triadimefon; zebrafish (Danio rerio); Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus); acute toxicity

浙江省農業科學院科技創新能力提升工程項目

蔣金花(1985-)，女，博士，研究方向為農藥毒理學，E-mail: jinhuajjh@sina.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: zhaoxueping@tom.com

10.7524/AJE.1673-5897.20141118002

2014-11-18錄用日期：2014-12-30

1673-5897(2015)5-150-07

X171.5

A

趙學平(1969-)，男，本科，研究員，主要研究方向為農藥應用與毒理學，發表學術論文60余篇。

蔣金花, 吳聲敢, 陳江濱, 等. 三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生長階段的急性毒性比較[J]. 生態毒理學報，2015, 10(5): 150-156

Jiang J H, Wu S G, Chen J B, et al. Acute toxicity effects of triadimefon on different life stages of zebrafish (Danio rerio) and Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 150-156 (in Chinese)