HPLC法測定補腎活血止痛丸中阿魏酸的含量

夏方亮

（濱州市食品藥品檢驗檢測中心，山東濱州256618）

HPLC法測定補腎活血止痛丸中阿魏酸的含量

夏方亮

（濱州市食品藥品檢驗檢測中心，山東濱州256618）

目的建立高效液相色譜法測定補腎活血止痛丸中阿魏酸的含量測定方法。方法用C18柱為固定相，以乙腈－0.085%磷酸溶液（14∶86）為流動相，檢測波長為316 nm。結果阿魏酸進樣量在0.020 49～0.204 9μg范圍內呈良好的線性關系，r＝1（n＝7），其平均回收率（n＝6）為99.83%。方法的檢測限LOD為0.307 3 ng，定量限LOQ為1.024 3 ng。結論此方法可靠、準確、專屬性強。

補腎活血止痛丸；阿魏酸；高效液相色譜法

補腎活血止痛丸由濱州市中醫院配制，具補肝腎、活血、祛瘀和止痛之功效，用于頸、肩、腰、腿痛經久不愈及緩解期。本品處方中有當歸、川芎等18味藥材，而原質量標準中沒有含量測定項，藥品質量不能得到有效控制，本文采用高效液相色譜（HPLC）法測定當歸和川芎中阿魏酸的含量，具有較高的準確性，可作為該制劑的含量測定方法。

1 儀器與試藥

島津LC－20AT高效液相色譜儀；Prominence SPD－20A／UV－VIS檢測器；補腎活血止痛丸（濱州市中醫院，批號：20130716、20130813、20130919）；阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110773－201313，含量以99.6%計，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h以上后使用）；甲醇和乙腈（色譜純，美國Tedia公司），其余試劑為分析純；純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Thermo BDS Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈－0.085%磷酸溶液（14∶86）為流動相；檢測波長為316 nm［1～5］。柱溫：35℃，流速：1.0 mL·min－1。理論塔板數按阿魏酸峰計算不低于3 000，阿魏酸峰與相鄰峰的分離度應符合要求。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品25.71 mg，置25 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液（濃度為1.024 3 mg·mL－1）。再精密量取上述對照品儲備液1 mL，置100 mL棕色量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（濃度為0.010 243 mg·mL－1）。

2.3 供試品溶液的制備 取本品研細，取細粉約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.4 陰性空白溶液的制備 取缺當歸和川芎的處方量，按照制法項制備陰性樣品，按“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備陰性空白溶液。

照“2.1”項下色譜條件，分別精密量取對照品溶液、供試品溶液和陰性空白溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，色譜圖見圖1。結果表明：理論板數按阿魏酸峰計算為15 026，阿魏酸峰與相鄰峰分離度符合要求。

圖1 補腎活血止痛丸阿魏酸含量測定HPLC圖譜A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性空白溶液

2.5 線性關系考察 分別精密量取“2.2”項下的對照品溶液（濃度為0.010 243 mg·mL－1）2、4、8、10、14、16、20μL注入液相色譜儀，分別測定峰面積。以阿魏酸對照品的進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為：Y＝5 108 890X－5 003（r＝1）。結果表明，阿魏酸進樣量在0.020 49～0.204 9μg之間與峰面積呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 精密量取“2.2”項下的阿魏酸對照品溶液（濃度為0.010 243 mg·mL－1）10μL，注入液相色譜儀，連續進樣6次，測其峰面積，RSD為0.44%。結果表明，儀器的精密度良好。

2.7 溶液的穩定性試驗 取“2.3”項下制備的供試品溶液，精密量取10μL，注入液相色譜儀，避光條件下每隔4 h進樣1次，測定阿魏酸的峰面積，共考察24 h，峰面積RSD為0.92%。結果表明，避光條件下，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗 取樣品（批號：20130716），按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法，平行制備6份樣品溶液，按上述方法和條件進行測定，計算每份樣品阿魏酸的含量（mg·g－1），RSD為1.2%。結果表明，本品含量測定方法的重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取已測知含量的補腎活血止痛丸（批號：20130716，阿魏酸含量為0.063 4 mg·g－1）約1.5 g，精密稱定，共取6份，置25 mL量瓶中，在每一份樣品中精密加入阿魏酸對照品溶液10 mL（濃度為0.010 243 mg·mL－1），加70%甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。按上述測定方法進行測定，計算回收率，結果見表1。

表1 阿魏酸加樣回收率試驗結果

試驗結果表明，阿魏酸用該測定方法回收率良好。

2.10 樣品測定 按“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，以“2.2”項下溶液作為對照品溶液，測定3批樣品中阿魏酸的含量，測定結果見表2。

表2 補腎活血止痛丸阿魏酸含量測定結果

2.11 檢測限LOD與定量限LOQ 取“2.2”項下對照品溶液，逐級減少進樣量，以信噪比為3∶1時，計算檢測限；以信噪比為10∶1時，計算定量限。結果為：檢測限LOD＝0.307 3 ng，定量限LOQ＝1.024 3 ng。

3 討論

3.1 阿魏酸溶液在光照條件下穩定性差，很快分解，反映在液相色譜上有2個峰，試驗中應采用棕色量瓶并避光，對照品溶液應臨用新配。

3.2 在制備供試品溶液時，本文考察了不同提取方法（超聲和回流）［6，7］、不同提取溶劑［甲醇、70%甲醇和乙醇∶水（1∶3）］［8～11］、不同提取時間（15、30和45 min）和不同取樣量（2.0、3.0、4.0 g）等條件下，樣品中阿魏酸的含量測定結果。

試驗表明，阿魏酸采用超聲提取30 min與回流提取1 h所測得結果沒有顯著性差異；采用70%甲醇提取所測樣品中阿魏酸的含量較高；超聲提取15 min測得阿魏酸含量偏低，30 min和45 min阿魏酸的含量測定結果沒有顯著差異；3種取樣量所測得的含量結果無顯著性差異。綜合考察試驗結果后確定了“2.3”項下供試品溶液的制備方法。

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Determ ination of ferulic acid in Bushen Huoxue Zhitong Pills by HPLC

XIA Fang-liang
（Binzhou Food and Drug Inspection and Testing Center，Binzhou 256618，China）

ObjectiveTo establish a method for the determination of ferulic acid in Bushen Huoxue Zhitong Pills by HPLC.MethodsThe C18column was used，themobile phase was consisted of acetonitrile－0.085%phosphoric acid（14∶86），and the detection wavelength was 316 nm.ResultsThe standard curves of ferulic acid was linear in range of 0.020 49～0.204 9μg，r＝1（n＝7），and the average recovery was 99.83%（n＝6）.The limit of detection was 0.307 3 ng and the limit of quantification was 1.024 3 ng.ConclusionThemethod was reliable，accurate and specific.

Bushen Huoxue Zhitong Pills；Ferulic acid；HPLC

R927.2

A

2095－5375（2015）08－0447－003

夏方亮，男，研究方向：藥品質量研究，E－mail：xiafl1980＠126.com