0.1%玻璃酸鈉滴眼液的抑菌效力研究

夏曉君，董愛梅，張建強

（1.解放軍第107醫(yī)院，山東煙臺264002；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東濟(jì)南250101；3.山東省皮膚和黏膜給藥技術(shù)重點實驗室，山東濟(jì)南250101）

0.1%玻璃酸鈉滴眼液的抑菌效力研究

夏曉君1，董愛梅2，張建強3

（1.解放軍第107醫(yī)院，山東煙臺264002；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東濟(jì)南250101；3.山東省皮膚和黏膜給藥技術(shù)重點實驗室，山東濟(jì)南250101）

目的探索0.1%玻璃酸鈉滴眼液中抑菌劑的合理添加劑量。方法根據(jù)藥物成分的特性，選擇適宜的抑菌劑，并對不同配比濃度抑菌劑的抑菌效果進(jìn)行初步考察，篩選出適宜的供試品抑菌劑加入量。將《中國藥典》規(guī)定的微生物加入供試品中進(jìn)行挑戰(zhàn)試驗，測試微生物在不同時間段的存活情況。結(jié)果0.005%的苯扎氯銨對5種挑戰(zhàn)微生物的生長有良好的抑制作用，且為最低有效劑量。結(jié)論0.005%的苯扎氯銨可作為0.1%玻璃酸鈉滴眼液的抑菌劑。

0.1%玻璃酸鈉滴眼液；抑菌效力；苯扎氯銨

目前，眼用制劑大多為多次使用的多劑量包裝，開蓋后的反復(fù)使用容易因患者或環(huán)境等因素受到污染，尤其是活性有效成分自身不具有足夠的抑菌或殺菌作用時，應(yīng)在制劑中添加適宜的抑菌劑。對于抑菌劑的添加與否、抑菌劑的種類和濃度等問題，一直是人們持續(xù)關(guān)注的焦點［1～3］。匹配的抑菌劑應(yīng)從安全性、有效性和穩(wěn)定性3個方面滿足產(chǎn)品的需求，因此，在藥物研發(fā)階段，抑菌效力研究被當(dāng)作處方工藝研究、質(zhì)量研究和標(biāo)準(zhǔn)制定過程中非常重要的一個環(huán)節(jié)。近年來國內(nèi)眼用制劑研發(fā)也在轉(zhuǎn)型中，已經(jīng)從單方面注重活性有效成分，開始全面評價產(chǎn)品質(zhì)量，包括眼用制劑中抑菌劑的合理使用以及質(zhì)量控制。歐美藥典均登載了研究抑菌劑抑菌效力的方法。參考美國藥典USP38相關(guān)要求，《中國藥典》2010年版（二部）附錄列出了抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則，對相關(guān)制劑包括眼用制劑中添加的抑菌劑進(jìn)行了規(guī)范和約束；《中國藥典》2015年版［4］參考《歐洲藥典》EP8.5的相關(guān)要求繼續(xù)提高了這方面的標(biāo)準(zhǔn)。

0.1%玻璃酸鈉滴眼液適用于干燥綜合征、干眼綜合征等內(nèi)因性及手術(shù)后、藥物性、外傷、配戴隱形眼鏡等外因性造成的角結(jié)膜上皮損傷，療效良好。我們參考《中國藥典》2015年版對0.1%玻璃酸鈉滴眼液的抑菌劑濃度進(jìn)行了篩選，對其抑菌效力進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超凈工作臺（ESCO，IEC6010－1）；恒溫數(shù)顯水浴鍋（國華電器，HH－2）；恒溫數(shù)顯培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)，BSP－250）；離心機（Spectrafuge，6c）；高壓滅菌鍋（上海博訊實業(yè)，YXO－LS－75 SI）；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)，GZX－9140 MBE）；一次性刻度吸管（1、2、10 mL）；一次性培養(yǎng)皿（Sterilin）；接種環(huán)；手動菌落計數(shù)器（北京賽百奧，XK－97c）；自動菌落計數(shù)器（Interscience，Scan500）；超低溫冰箱（Thermo scientific，700系列）。

1.2 材料 金黃色葡萄球菌（CMCC26003）；銅綠假單胞菌（CMCC10104）；大腸埃希菌（CMCC44102）；白色念珠菌（CMCC98001）；黑曲霉（CMCC98003）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）；大豆酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）；Letheen中和肉湯；磷酸鹽緩沖液；0.9%氯化鈉溶液；含聚山梨酯80（Tween 80）的0.9%氯化鈉溶液；0.1%玻璃酸鈉滴眼液（山東省藥學(xué)科學(xué)院）。

2 試驗方法

2.1 菌液的制備 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌于30～35℃條件下分別培養(yǎng)18～24 h，白色念珠菌于20～25℃條件下培養(yǎng)48～52 h，取各菌用適量無菌0.9%氯化鈉溶液洗脫，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中用適量無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋，使菌懸液濃度為107～108 cfu·mL－1。

黑曲霉于20～25℃條件下培養(yǎng)7 d，用適量含聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液洗脫孢子，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，離心（5 000～6 500 rpm×8 min）。棄上清，加適量無菌0.9%氯化鈉溶液，渦旋混合，使菌懸液濃度為107～108 cfu·mL－1。

2.2 供試品情況 根據(jù)文獻(xiàn)報道［5，6］，苯扎氯銨對銅綠假單孢菌和黑曲霉抗菌活性相對較弱。苯扎氯銨含量高于0.01%時，對5種試驗菌具較強的殺滅作用，而苯扎氯銨含量等于或低于0.001%時則對黑曲霉已經(jīng)基本無抑制作用。因此，對苯扎氯銨含量0.01%和0.001%之間的濃度做進(jìn)一步篩選，以濃度具有代表性和易于配制供試品為原則，設(shè)計0.1%玻璃酸鈉滴眼液中苯扎氯銨的濃度。

設(shè)計供試品條件：a組（含0.001%苯扎氯銨的供試品）、b組（含0.003%苯扎氯銨的供試品）、c組（含0.005%苯扎氯銨的供試品）、d組（含0.01%苯扎氯銨的供試品）。上述4組供試品，裝量均為5 mL，分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單孢菌、白色念珠菌菌懸液和黑曲霉孢子懸液，進(jìn)行抑菌效力試驗。

2.3 測定方法

2.3.1 0 h測定 各供試品組分別取磷酸鹽緩沖液5支、0.1%玻璃酸鈉滴眼液5支各20 mL，分別依次接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉。接種的菌懸液體積為供試品體積的0.7%。磷酸鹽緩沖液梯度稀釋接種后，取接近的稀釋級，接種2個平皿做平行對照。接種后均放入20～25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在各測定時間點時進(jìn)行梯度稀釋。同時平行進(jìn)行中和劑驗證，菌落回收率不低于70%，說明該試驗方法及材料均適用于0.1%玻璃酸鈉滴眼液。

2.3.2 6 h測定 各供試品分別取0.1%玻璃酸鈉滴眼液5支各1 mL，用中和肉湯梯度稀釋，取濃度符合要求的稀釋液于平皿中，接種2個平皿做平行對照，分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)基。細(xì)菌于30～35℃條件下培養(yǎng)3～5 d，白色念珠菌于20～25℃條件下培養(yǎng)3～5 d，黑曲霉于20～25℃條件下培養(yǎng)3～7 d，并計菌落數(shù)。

2.3.3 24 h、7 d與28 d測定 方法同6 h測定。

2.3.4 測定時間及判斷標(biāo)準(zhǔn) 見表1。表中的“減少的lg值”是指各間隔時間測定的菌數(shù)lg值與1 mL（g）供試品中接種的菌數(shù)lg值的相差值。表中“A”是指應(yīng)達(dá)到的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)，特殊情況下，如抑菌劑可能增加不良反應(yīng)的風(fēng)險，那至少應(yīng)達(dá)到“B”的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。

表1 0.1%玻璃酸鈉滴眼液抑菌效力測試時間點和判斷標(biāo)準(zhǔn)

2.4 中和劑的驗證［4，7］6 h、24 h、7 d、28 d測定中，需要加入適宜的中和劑消除0.1%玻璃酸鈉滴眼液中剩余的抑菌劑。0 h測定時，分別取中和肉湯5支各9 mL，pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液5支各10 mL。在9 mL中和肉湯中分別加入0.1%玻璃酸鈉滴眼液1 mL，中和10 min，作為中和劑對照組；10 mL pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液作為菌液對照組，兩組分別加入適宜濃度的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液各0.1 mL，混勻，使每1 mL供試液中含菌量不超過100 cfu，分別取兩組個試驗菌液接種至2個平皿做平行對照，加入適宜的培養(yǎng)基，培養(yǎng)計數(shù)。中和劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)比值應(yīng)在0.5～2.0之間。

3 實驗結(jié)果

3.1 中和劑的驗證結(jié)果 見表2，回收率均大于70%，表明中和肉湯滿足實驗要求，能夠消除滴眼液中殘余的抑菌能力。

表2 中和劑驗證菌落數(shù)及結(jié)果

3.2 抑菌效力測定結(jié)果 結(jié)果見表3。

表3 試驗組菌量減少lg值

試驗結(jié)果表明，a、b、c、d 4組供試品對金黃色葡萄球菌均有較強的抑制作用，4組供試品對銅綠假單孢菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的抑制作用隨抑菌劑濃度的增大而呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，符合《中國藥典》2015年版判斷標(biāo)準(zhǔn)。其中抑菌劑含量較高的c、d組，與初始值比較，各測定時間點的菌計數(shù)結(jié)果表現(xiàn)出較為明顯的減少趨勢，尤其在對白色念珠菌的抑制作用上。以上4組試驗組中，符合《中國藥典》2015年版抑菌劑效力檢查法結(jié)果判斷“A”標(biāo)準(zhǔn)的有c、d 2組，根據(jù)“所有抑菌劑都具有一定的毒性，制劑中抑菌劑的量應(yīng)為最低有效量”［5］這一原則，應(yīng)選取抑菌劑含量最低的c組中的抑菌劑濃度，作為正式產(chǎn)品的處方濃度。

4 討論

《中國藥典》2015年版更新了抑菌效力檢查法，并根據(jù)歐美藥典的最新要求對抑菌效力的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提高。多劑量包裝的滴眼液需要在處方中適當(dāng)添加適宜的抑菌劑來保持滴眼液產(chǎn)品在貯存和使用過程，尤其是使用過程中具有一定的抑菌能力，同時考慮添加的抑菌劑多少都會具有一定的毒性，因此必須進(jìn)行充分的試驗研究，嚴(yán)格控制抑菌劑的種類和用量，保證用藥安全。

苯扎氯銨為國內(nèi)外常用的抑菌劑，若不存在嚴(yán)重的配伍禁忌，為大多數(shù)滴眼液中所常用［8］。按照《中國藥典》2015年版抑菌劑效力檢查法對0.1%玻璃酸鈉滴眼液中使用苯扎氯銨的濃度進(jìn)行了篩選，最終確定0.005%的苯扎氯銨可用作0.1%玻璃酸鈉滴眼液的抑菌劑。處方中苯扎氯銨濃度為0.005%時，0.1%玻璃酸鈉滴眼液對革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌）、革蘭陰性菌（銅綠假單孢菌和大腸埃希菌）、酵母菌（白色念珠菌）和真菌（黑曲霉）均有較強的抗菌活性，符合《中國藥典》2015年版抑菌抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)。

［1］ 寧黎麗.眼用制劑研發(fā)過程中應(yīng)關(guān)注抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制［J］.中國藥學(xué)雜志，2007，42（23）：1836－1838.

［2］ 林吉恒，肖璜，陳萬勝，等.氯霉素滴眼劑處方中硫柳汞含量的合理性分析［J］.中國藥師，2014，7（10）：1687－1690.

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［4］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

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［8］ 張琳，劉葵葵，王伶.HPLC法同時測定阿奇霉素滴眼液中阿奇霉素及苯扎氯銨的含量［J］.齊魯藥事，2012，31（12）：705－707.

Studies on antim icrobial effectiveness of Sodium Hyaluronate Eye Drops（0.1%）

XIA Xiao-jun1，DONG Ai-mei2，ZHANG Jian-qiang3
（1.The People′s Liberation Army 107 Hospital，Yantai264002，China；2.Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences，Jinan 250101，China；3.Shandong Provincial Key Laboratory of Mucosal and Transdermal Drug Delivery Technology，Jinan 250101，China）

ObjectiveTo investigate the optimal concentration of antimicrobial preservative thatwas added to Sodium Hyaluronate Eye Drops（0.1%）.MethodsAccording to the characteristic of ingredients，select several concentrations of antimicrobial preservative on the basis of the ingredients of the product.Test the antimicrobial effectiveness of antimicrobial preservatives at different ratio.Inoculate the concentration of testmicroorganisms to the products，then estimate the viable microorganisms in different times.ResultsThe growth of testmicroorganismswere inhibited effectively by Sodium Hyaluronate Eye Drops possess of 0.005%benzalkonium chloride which was also the minimum effective dosage.Conclusion0.005%benzalkonium chloride can be used as antimicrobial preservative for Sodium Hyaluronate Eye Drops（0.1%）.

Sodium Hyaluronate Eye Drops（0.1%）；Bacteriostatic potency；Benzalkonium chloride

R944.1

A

2095－5375（2015）08－0455－003

夏曉君，女，副主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)，E－mail：xxj＿107＠126.com。