HPLC測定肉蓯蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量

2015-03-15 05:32:02田玉彪楊廣安黃維杰向仕珍王慧娟貴州大學藥學院貴州貴陽550025貴州省中藥民族藥創制工程中心貴州貴陽550025貴州省藥食同源植物資源研究開發中心貴州貴陽550025

安徽農業科學 2015年33期

田玉彪，楊廣安,2,3，黃維杰，向仕珍，王慧娟,2,3，周英,2,3*　(.貴州大學藥學院，貴州貴陽 550025；2.貴州省中藥民族藥創制工程中心，貴州貴陽 550025；3.貴州省藥食同源植物資源研究開發中心，貴州貴陽 550025)

田玉彪1，楊廣安1,2,3，黃維杰1，向仕珍1，王慧娟1,2,3，周英1,2,3*(1.貴州大學藥學院，貴州貴陽 550025；2.貴州省中藥民族藥創制工程中心，貴州貴陽 550025；3.貴州省藥食同源植物資源研究開發中心，貴州貴陽 550025)

摘要[目的]建立高效液相色譜法同時測定肉蓯蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。[方法]采用安捷倫1260高效液相色譜儀和Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫，流速1 ml/min，檢測波長330 nm，柱溫30 ℃。[結果]松果菊苷和毛蕊花糖苷進樣量分別在0.40～4.00、0.44～44.00 μg范圍內均與峰面積呈良好線性關系，平均回收率分別為97.4%和101.3%，RSD分別為1.70%、1.52%。[結論]該方法簡單可行、重現性好、精密度高、結果可靠，可用于同時測定肉蓯蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。

關鍵詞高效液相色譜法；肉蓯蓉微粉；松果菊苷；毛蕊花糖苷；含量測定

Determination on the Content of Echinacoside and Acteoside fromHerbaCistancheMicro Powder by HPLC

TIAN Yu-biao1,YANG Guang-an1,2,3,HUANG Wei-jie1,ZHOU Ying1,2,3*et al(1.College of Pharmacy,Guizhou University, Guiyang,Guizhou 550025;2.Guizhou Engineering Center for innovative Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine, Guiyang,Guizhou 550025;3.Guizhou Research and Development Center of Medicinal and Edible Plant Resources, Guiyang,Guizhou 550025)

Abstract[Objective] The research aimed to establish the HPLC method for determining the content of echinacoside and acteoside fromHerbaCistanchemicro powder.[Method]Agilent 1260 high performance liquid chromatograph and waters C18column(5 μm,4.6 mm×250 mm) were adopted.The mobile phase was mixture of methanol and 0.1% formic acid water solution gradient elution.The flow rate was 1 ml/min,the detection wavelength was 330 nm,the column temperature was 30 ℃.[Result]The linear ranges of echinacoside and acteoside were 0.40-4.00 and 0.44-44.00 μg respectively,the average recoveries were 97.4%(RSD=1.7%)and 101.3%(RSD=1.52%)respectively,RSDwere 1.70% and 1.52% respectively.[Conclusion] The method was simple and feasible, good reproducibility, high precision and reliable results.It can be used as quantitative determination for the content of echinacoside and acteoside fromHerbaCistanchemicro powder.

Key wordHPLC;HerbaCistanche;Echinacoside；Acteoside;Content determination

肉蓯蓉(HerbaCistanche)為列當科(Oroban-chaceae)植物肉蓯蓉(CistanchedeserticolaMa)的帶鱗片的干燥肉質莖,又名蓯蓉、大蕓、金筍、地精，始載于《神農本草經》列為上品。其味甘、咸，性溫，歸腎、大腸經，具有補腎陽、益精血、潤腸通便功能[1]。目前，肉蓯蓉已分離出多種類型的物質,主要可分為苯乙醇苷類、環烯醚萜類、木脂素類、多糖、生物堿等[2-3]。藥理試驗證實，肉蓯蓉中的苯乙醇總苷,類葉升麻苷均具有促性激素樣、雄激素樣及增強小鼠非特異性免疫功能等作用[4-6]。

在中藥浸出物制備過程中，合適粒度使得中藥指標性成分最大限度的溶出,提高其釋放速度和利用率,中藥有效成分的浸出與擴散面積(粉碎度)和擴散時間有關[7-9]。在肉蓯蓉含量測定方面,張思巨等[10]建立HPLC同時測定肉蓯蓉藥材中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量的方法,并測定野生藥材的含量；王長林等[11]采用HPLC法分析不同生長周期、不同部位管花肉蓯蓉中松果菊苷的指紋圖譜。目前，對肉蓯蓉微粉的研究較少，該試驗對肉蓯蓉藥材進行微粉化處理，以其質量控制作為研究目標，參照2010版《中國藥典》，采用HPLC同時測定肉蓯蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，以期為中藥材生產加工節省中藥資源、減少生產環節、降低設備投資、縮短生產周期。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器。安捷倫1260高效液相色譜儀和Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，G1311C輸液泵，G1316A柱溫箱，G1329自動進樣器，G1314F-VWD紫外檢測器，Chemstation色譜工作站。FA2004 型電子分析天平( 上海良平儀器有限公司) ，超微粉碎機(濟南倍力粉技術工程有限公司)，超聲儀(KQ-500型，昆山市超聲儀器有限公司)等。

1.1.2藥材及試劑。收集到6批肉蓯蓉樣品，經貴州大學貴州省中藥民族藥創制工程中心鑒定為肉蓯蓉，超微粉碎機粉碎，過400目篩，放置干燥器備用。松果菊苷(批號111670-201304)及毛蕊花糖苷(批號111503-201411)對照品，均購于中國食品藥品檢定研究院，甲醇(ACS,Reag.Ph Eur)，自制高純水。

1.2方法

1.2.1對照品溶液的制備。取松果菊苷及毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇配制成每1 ml含松果菊苷0.20 mg和毛蕊花糖苷0.22 mg的混合對照品溶液，避光，4 ℃環境儲存備用。

1.2.2供試品溶液的制備。取供試品粉末(過400目篩)約1 g，精密稱定，置100 ml棕色容量瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，搖勻，稱定重量，浸泡30 min，超聲處理40 min(功率250 W，頻率35 kHz)，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

1.2.3色譜條件。采用安捷倫1260高效液相色譜儀和Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，G1314F-VWD紫外檢測器的檢測波長為330 nm；流動相為甲醇與0.1%甲酸水溶液，按不同比例混合(0～17 min：26.5∶73.5,17～25 min：29.5∶70.5,25～40 min：29.5∶70.5,)；進樣量10 μl，流速1 ml/min，柱溫30 ℃，理論板數按松果菊苷、毛蕊花糖苷峰計算應不低于3 000。

1.2.4方法學考察。

1.2.4.1線性關系考察。精密吸取毛蕊花糖苷及松果菊苷對照品儲備液2、4、6、8、10、20 μl，經0.45 μm的微孔濾膜過濾后，在“1.2.3”色譜條件下測定峰面積，以對照品溶液濃度為橫坐標x、峰面積為縱坐標y，繪制標準曲線并進行回歸分析。

1.2.4.2精密度試驗。精密吸取毛蕊花糖苷及松果菊苷對照品儲備液10 μl，按“1.2.3”色譜條件連續進樣6次，以峰面積計算毛蕊花糖苷及松果菊苷的RSD。

1.2.4.3重復性試驗。按“1.2.2”方法制備供試溶液，經0.45 μm的微孔濾膜過濾后，精密吸取供試溶液10 μl，按“1.2.3”色譜條件連續進樣6次，以峰面積計算毛蕊花糖苷及松果菊苷的RSD。

1.2.4.4穩定性試驗。按“1.2.2”方法制備供試溶液,經0.45 μm的微孔濾膜過濾后，每隔4 h精密吸取供試溶液10 μl，按“1.2.3”色譜條件分別于0、4、8、12、20、24 h連續進樣6次，以峰面積計算毛蕊花糖苷及松果菊苷的RSD。

1.2.4.5回收率試驗。精密稱取6份已知含量的樣品各0.5 g，分別精密加毛蕊花糖苷及松果菊苷標準溶液適量，按“1.2.2”方法制備溶液，按“1.2.3”色譜條件進樣分析，測定峰面積，計算各成分的量及回收率。

1.2.5樣品含量測定。精密稱取6批次肉蓯蓉樣品各3份，每份1 g，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件進樣分析，測定峰面積，計算毛蕊花糖苷及松果菊苷的含量，數據的表示方法為x±SD。

2結果與分析

2.1方法學考察

2.1.1線性關系。按“1.2.4.1”方法操作，以對照品溶液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結果顯示松果菊苷和毛蕊花糖苷的線性回歸方程分別為y=1 312.3x+24.944(R2=1.000 0)、y=1 554.0x+33.02(R2=0.999 9)，表明松果菊苷和毛蕊花糖苷分別在0.40～4.00、0.44～4.40 μg的范圍內呈良好的線性關系。

2.1.2精密度試驗。按“1.2.4.2”方法操作，計算得毛蕊花糖苷和松果菊苷的RSD分別為0.29%和0.49%，表明儀器精密度試驗合格。

2.1.3重復性試驗。按“1.2.4.3”方法操作，測得毛蕊花糖苷和松果菊苷的RSD分別為0.82%和0.52%，表明該方法重復性良好。

2.1.4穩定性試驗。按“1.2.4.4”方法操作，根據峰面積計算毛蕊花糖苷及松果菊苷的RSD分別為1.75%和1.90%,表明供試液在24 h內穩定性良好。

2.1.5回收率試驗。由表1可見，該方法測定肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的平均回收率分別為97.4%、101.3%，RSD分別為1.70%、1.52%，表明該方法準確、可靠，可用于肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量測定。

表1　肉蓯蓉中松果菊苷及毛蕊花糖苷回收率

2.2不同批次肉蓯蓉微粉中松果菊苷及毛蕊花糖苷的含量由表2可知，不同收集批次肉蓯蓉中松果菊苷含量最大的為17.8 mg/g、最小的為13.6 mg/g，毛蕊花糖苷含量最大的為12.3 mg/g、最小的為8.2 mg/g，說明不同收集批次肉蓯蓉中松果菊苷及毛蕊花糖苷的含量有較大的差異?？梢?，肉蓯蓉藥材質量因植株個體情況存在明顯的差異。從圖1可看出，松果菊苷及毛蕊花糖苷的分離度均較好，在“1.2.3”色譜條件下，樣品分離良好；混合標準品儲備液中松果菊苷及毛蕊花糖苷的保留時間分別為17.44、34.84 min，在樣品溶液色譜峰中松果菊苷及毛蕊花糖苷的保留時間分別為17.43、35.04 min。由于受運行時間或沖洗時間的影響，樣品松果菊苷及毛蕊花糖苷的保留時間與標準品不完全一致，但在誤差允許的范圍內。

3討論

近年對肉蓯蓉的研究報道文獻較多，但對肉蓯蓉微粉化的研究報道甚少，該試驗參照2010版《中國藥典》及相關文獻對其微粉化進行研究，以肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷為考察指標，采用高效液相色譜法(HPLC)測定其微粉化中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量及其穩定性考察。結果表明，松果菊苷和毛蕊花糖苷進樣量分別在0.40~4.00、0.44~44.00 μg范圍內均與峰面積呈良好線性關系，平均回收率分別為97.4%和101.3%，RSD分別為1.70%、1.52%。該方法簡單可行、重現性好、精密度高、結果可靠，可用于同時測定肉蓯蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。

表2不同收集批次肉蓯蓉微粉中松果菊苷及毛蕊花糖苷含量測定結果

該試驗中發現肉蓯蓉中毛蕊花糖苷在常溫下放置容易變質，配制好的儲備液應盡快使用，同時于陰涼避光處儲存。

通過對原生藥材進行超細粉碎,可以得到更加適合于機體吸收、利用的微粉藥材,從而大大提高原生藥材的生物利用度和其治療效果，因此用微粉提高肉蓯蓉的利用率是一個行而有效的辦法[12]，肉蓯蓉微粉化研究為其微粉化制劑的開發奠定理論基礎，也為進一步開發利用肉蓯蓉資源以及深入挖掘其在食品、醫學領域的應用提供了一定的參考價值，對企業中藥材加工有一定的指導意義。

參考文獻

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