α硫辛酸對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠軸索損傷的保護作用

周 毅，朱一飛，李世平，王 穎，檀紅玲，檀國軍

（河北醫科大學第二醫院神經內科，河北 石家莊050000）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是以中樞神經系統脫髓鞘為主要病理變化的疾病［1］。既往研究認為，中樞神經系統原發性脫髓鞘病變是導致MS患者出現神經功能障礙的主要因素［2］。近年來研究證實，除炎性脫髓鞘病變外，MS發病過程中往往還合并軸索損傷，且軸索損傷程度與MS病情嚴重程度密切相關［3］。因此，研究 MS軸索損傷機制及其相關軸索損傷保護作用正成為近年的研究熱點。α硫辛酸作為強抗氧化劑，可有效抑制機體內脂質過氧化反應，清除活性氧自由基，其對糖尿病周圍神經病變患者周圍神經的保護功能已得到公認［4-5］。但α硫辛酸對MS軸索損傷的保護作用尚未明確。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型可有效演繹MS的發病過程，是臨床研究MS最常用的動物模型。本研究以EAE模型大鼠作為研究對象，分別采用α硫辛酸和地塞米松進行藥物干預，觀察藥物干預對EAE大鼠發病情況和軸索組織病理改變的影響，探討α硫辛酸對MS軸索損傷的保護作用，旨在為臨床MS治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 豚鼠10只，雄性，體質量350～400 g。Wistar大鼠36只，雌性，體質量180～200g，6～8周齡。以上動物均購于河北醫科大學第二醫院實驗動物中心。

1.2 試驗試劑及設備 α硫辛酸、地塞米松、完全弗氏佐劑（美國Sigma公司）；高速低溫離心機（日本三洋SCR20B型）。

1.3 動物模型建立 取上述豚鼠10只，采用10%水合氯醛（0.5mL／100g）進行靜脈麻醉，斷頸處死，于低溫環境下取出豚鼠脊髓并去除脊髓膜和馬尾，稱質量并加入等質量的4℃生理鹽水，采用勻漿機制備全脊髓勻漿（guinea pig spinal cord homogenate，GPSCH），之后加入等體積完全弗氏佐劑，二者充分混合后制成油包水型抗原乳劑，4℃保存備用。剩余36只Wistar大鼠，取四肢足墊及背部皮下5點為注射部位，分別給大鼠注射上述油包水型抗原乳劑（0.5mL／只），并以此建立EAE動物模型。

1.4 動物干預及分組 待EAE大鼠第1次發病后將EAE大鼠隨機分為3組，即EAE組、LA組和DXM組，每組12只。各組自第1天發病起分別給予不同藥物進行腹腔注射，LA組給予α硫辛酸（100mg·kg-1·d-1），DXM 組給予地塞米松（2 mg·kg-1·d-1），EAE組給予等體積生理鹽水，連續注射7d。

1.5 神經功能檢測［6］神經功能評價參照Kono［7］評分標準：僅尾部無力，其余部位正常記1分；尾部、雙前肢和（或）雙后肢無力記為2分；尾部無力，雙前肢或雙后肢癱瘓，但被動翻身后仍可復原記為3分；尾部無力，雙前肢及雙后肢癱瘓，被動翻身后無法復原記為4分；瀕死狀態或死亡記為5分。

1.6 組織病理學 受試大鼠處死，快速取脊髓腰膨大組織并固定于40g／L多聚甲醛中。PBS緩沖液沖洗標本，常規梯度乙醇溶液進行標本脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋。采用改良三色染色法進行組織切片染色。

1.7 統計學方法 應用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用q檢驗；計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 實驗大鼠第1次發病情況 GPSCH誘導免疫后，大鼠陸續出現精神不振、食欲下降、皮毛雜亂等癥狀；第12天大鼠第1次發病，主要表現為尾部無力、雙前肢和（或）雙后肢肌張力下降甚至癱瘓、斜頸、無法抬頭等；第14天大鼠進入發病高峰期，臨床癥狀加重，主要表現為四肢麻痹無力（雙后肢更甚），多合并大小便失禁和精神癥狀（易激惹、攻擊行為）。

2.2 復發率 LA組和DXM組復發率均明顯小于EAE組，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）；LA組與DXM組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組大鼠復發率比較Table 1 Recurrence rate in different groups（n＝12，只數，%）

2.3 神經功能缺損評分 發病后7d、14d，LA組和DXM組神經功能缺損評分均明顯低于EAE組，差異有統計學意義（P＜0.05）；DXM組神經功能缺損評分低于LA組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠神經功能缺損評分比較Table 2 Neurologic function score in different groups（n＝12，±s，分）

表2 3組大鼠神經功能缺損評分比較Table 2 Neurologic function score in different groups（n＝12，±s，分）

＊P＜0.05與EAE組比較 ＃P＜0.05與LA組比較（q檢驗）

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2.4 組織病理學 改良Bielschowsky銀染色結果顯示，正常對照組軸索粗細均勻、走行方向一致、軸索的連續性完好；EAE組出現不同程度軸索改變，可見軸突腫脹、增粗、彎曲，著色不均，呈鋸齒狀或串珠狀，不連續，甚至斷裂，髓鞘結構層次紊亂（圖1A）；LA組軸索改變較EAE組明顯減輕，但仍有少部分軸索腫脹、粗細不均、排列紊亂（圖1B）；DXM組軸索改變情況與LA組類似（圖1C）。

圖1 各組大鼠脊髓軸索組織病理切片（改良Bielschowsky銀染色×400）A.EAE組；B.LA組；C.DXM組Figure 1 Expression of spinal cord axon in different groups（improving Bielschowsky staining×400）

3 討 論

越來越多的證據支持軸索損傷在MS的發生與發展過程中發揮重要作用［6，8］。氫質子磁共振波譜檢查顯示，即使在損傷不明顯的MS患者腦區也出現N-乙酰天門冬氨（N-acetyl aspartate，NAA）／肌酸（creatine，Cr）比值下降現象，而 NAA／Cr比值變化與軸索損傷程度密切相關，提示MS早期即存在軸索損傷現象［9］。

本研究成功建立EAE大鼠模型，觀察結果顯示，模型大鼠至免疫誘導后第14天（發病期），陸續出現四肢麻痹無力、大小便失禁和精神表現異常等癥狀；首次發病之后第7天（緩解期）病情相繼緩解；首次發病后第14天大部分（復發期）大鼠再次出現肢體癱瘓癥狀，且此期癥狀表現比首次發病時更為嚴重，主要表現為極度消瘦（體質量下降20%～30%）、背部潰瘍、口鼻出血等。改良的三色染色法結果顯示EAE模型大鼠存在明顯軸索損傷現象，且病程各期表現不一，發病期軸索損傷明顯，緩解期軸索損傷有所減輕，復發期軸索損傷加重，更甚于首次發病期。本研究結果提示，EAE模型大鼠軸索損傷趨勢與其臨床病程進展一致，進一步佐證了軸索損傷與MS密切相關。探討MS軸索損傷保護機制可能是臨床治療MS的新思路。

近年來研究證實，自由基是誘發MS的重要因素［10-11］。由單核細胞產生的氧自由基可介導一系列氧化應激反應，從而導致脫髓鞘和軸突損傷；此外，自由基還可通過激活核轉錄因子κB，上調腫瘤壞死因子、血管內皮細胞黏附分子1和細胞間黏附分子1的表達，從而促進MS發生和發展。因此，調節機體氧自由基水平可能是治療MS的可靠途徑［12-13］。

α硫辛酸是線粒體脫氫酶的天然輔助因子，可有效清除活性氧自由基，阻斷脂質過氧化，從而減少機體氧化應激損傷。其對糖尿病周圍神經病變患者周圍神經的保護功能已得到公認。本研究顯示，采用α硫辛酸進行干預可明顯改善EAE模型大鼠神經功能損傷癥狀；組織病理學結果證實，α硫辛酸可明顯改善EAE所致的軸索損傷現象；此外，采用α硫辛酸進行干預可明顯降低EAE模型大鼠復發率。分析其原因可能與α硫辛酸對EAE所致的軸索損傷發揮保護作用有關。

綜上所述，α硫辛酸對EAE大鼠軸索損傷具有一定保護作用。然而，α硫辛酸對EAE的作用機制尚未完全明確，有待進一步深入研究。

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