結核感染T細胞檢測在兒童骨關節結核病中的診斷價值

賈晨光，姚黎明＊，李秀武，劉豐勝，章志華，張金文

（1.河北省胸科醫院骨科，河北 石家莊050041；2.河北省胸科醫院病理科，河北 石家莊050041；3.河北省胸科醫院科教處，河北 石家莊050041）

結核病（tuberculosis，TB）的診斷及控制是全球公共衛生面臨的難題。目前我國仍然是兒童結核感染發病率及病死率較高的發展中國家之一［1］。根據世界衛生組織公布的資料，2006年全球結核病例新增800萬，兒童病例約130萬，其中10%～20%為肺外結核［2］。骨關節結核是結核病在肺外器官最常見的類型，約占結核病總人數的13%左右，好發于兒童和青少年。對結核分枝桿菌感染患者的快速診斷及成功治療是遏止結核病廣泛并快速傳播的核心步驟。在臨床工作中，準確診斷兒童早期骨關節結核病尤為困難。目前國內關于結核感染T細胞斑點試驗（tuberculosis infection of T cells spot test，TSPOT.TB）應用于兒童活動性結核診斷中的研究報道數量較少。本研究旨在評估T-SPOT.TB診斷兒童骨關節結核病的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年10月—2014年10月河北省胸科醫院骨科收治的診斷為骨關節結核的患兒36例，男性26例，女性10例，年齡7個月～14歲，平均（7.40±4.27）歲。參考中華醫學會《臨床診療指南》結核病分冊相關診斷標準，根據病史、臨床特點、影像學表現、組織病理學、病原學檢查結果以及抗結核治療效果進行診斷。見表1。

表1 36例骨關節結核患兒臨床資料統計Table 1 Clinical characteristics of 36children patients confirmed with osteoarticular tuberculosis（n＝36，例數，%）

1.2 方法 所有患兒分別進行涂片抗酸染色、結核菌培養、實時熒光定量PCR檢測、結核菌素PPD試驗、T-SPOT.TB，比較其陽性檢出率。根據病變部位（脊柱／四肢關節）及年齡段（年齡≤3歲，＞3～6歲，＞6～9歲，＞9～14歲）分別比較T-SPOT.TB陽性檢出率。

1.2.1 涂片抗酸染色 所有診斷為骨關節結核病患者的標本處理均依據“中國防癆協會指導方針”［3］進行。將采集的關節腔積液、病灶膿液標本，經離心沉淀集菌后，用少量生理鹽水混勻沉淀物，均勻涂抹于載玻片上，自然干燥后，行抗酸染色鏡檢。

1.2.2 結核菌培養 將采集的關節腔積液、病灶膿液標本經消化處理后，接種于羅氏培養基上，37℃培養，接種后3d、7d觀察，此后每周觀察1次，有菌落生長后用抗酸染色驗證，若同時為陽性記錄為陽性，否則為陰性，至第8周仍無細菌生長記錄為陰性。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測 活檢或手術標本采用熒光定量試劑盒檢測結核分枝桿菌DNA，具體操作按試劑盒說明書進行。標本經去污和離心后，得到50μL DNA提取液，混勻后沸水煮10min，4℃放置6～8h。離心10 000r／min 5min，取上清用于實時熒光定量PCR檢測。

1.2.4 結核菌素PPD試驗 注射0.1mL（5U）于患兒的前臂掌側皮內，72h觀察注射部位的反應情況。評價標準參照“中國結核病防治規劃實施工作指南（2008版）”標準［4］：硬結直徑（d）＜5mm 為陰性（-）；5～10mm 為弱陽性（＋）；＞10～20mm為陽性（＋＋）；＞20mm或局部出現水泡、壞死或有淋巴炎為強陽性（＋＋＋）。

1.2.5 T-SPOT.TB 受試者用肝素鋰抗凝采血管抽取5mL靜脈血，即刻輕柔顛倒混勻3～5次，使抗凝劑充分溶解。3h內將采集的全血分裝到3種不同的培養管中，“T”為添加了結核特異性抗原早期分泌抗原靶蛋白6、培養濾液蛋白10的測試培養管，“N”為本底對照培養管，“P”為添加了非特異刺激原植物血凝素的陽性對照培養管，每種培養管分裝1mL，分裝前需要顛倒混勻3次以上，分裝后輕柔顛倒培養管5次并立刻置于37℃培養箱中，靜置培養（22±2）h后取出，離心收集上清液，然后用雙抗體夾心法定量檢測上清中γ干擾素的含量，最后計算刺激培養系統中特異性升高的γ干擾素的量來判定是否為結核桿菌感染陽性。

1.3 統計學方法 應用SSPS 14.0統計軟件進行數據分析，計數資料以百分率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各種檢測方法陽性檢出率比較 T-SPOT.TB陽性檢出率（75.00%，27／36）顯著高于涂片抗酸染色陽性檢出率（8.33%，3／36）、結核菌培養陽性檢出率（50.00%，18／36），差異有統計學意義（P＜0.05或＜0.01）；略高于實時熒光定量PCR檢測陽性檢出率（61.11%，22／36）及結核菌素PPD試驗陽性檢出率（66.67%，24／36），但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 T-SPOT.TB與其他臨床常用檢測方法陽性檢出率比較Table 2 The positive rate of T-SPOT.TB in comparison with other commonly used clinical methods （例數）

2.2 不同病變部位及年齡段T-SPOT.TB陽性檢出率比較 36例骨關節結核患兒中包括22例脊柱結核和14例關節結核患兒，T-SPOT.TB診斷脊柱結核的陽性檢出率高于四肢關節結核，但差異無統計學意義（P＞0.05）。36例骨關節結核患兒中年齡≤3歲10例，＞3～6歲4例，＞6～9歲6例，＞9～14歲13例，4個年齡段T-SPOT.TB陽性檢出率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同病變部位和年齡段T-SPOT.TB陽性檢出率比較Table 3 The positive rate of T-SPOT.TB for different locations and age stages of osteoarticular tuberculosis（例數，%）

3 討 論

目前結核病在全球已呈現明顯回升趨勢，兒童病例數亦有顯著增加。在臨床實際工作中時常會遇到令醫師尷尬的現象，即依臨床體征、影像學表現高度懷疑骨關節結核病變，并有紅細胞沉降率增快、C反應蛋白增高，但結核菌素試驗、結核抗體和穿刺液涂片、TB-DNA、結核菌培養等結核方面的特異性檢驗結果均為陰性，甚至手術后病理結果僅提示慢性感染。由于抗結核藥物治療是一個漫長的過程，一旦在誤診的條件下實施藥物治療，不僅會增加藥物不良反應的危險，骨關節破壞性病變也勢必加重，甚至產生不可修復的損害。在缺乏診斷結核病的細菌學或病理學證據的前提下能否給予接受試驗性抗結核藥物治療是擺在醫師與患兒家長面前無法回避的共同難題。查閱文獻資料并結合我們的臨床工作體會，造成早期兒童骨關節結核病診斷困難的原因可歸納為：①我國兒童普遍預防接種了卡介苗，機體對結核感染有一定抵抗能力，故早期兒童骨關節結核的臨床和影像學表現都不很典型；②患兒多為學齡前期兒童，故難于獲得準確主訴甚至無主訴，增加了診斷上的困難；③兒童骨關節結核病灶內載菌量較低，故相應組織學及病原學獲得陽性結果較為困難［5］。

回顧以往傳統檢測方法各有不足：抗酸染色檢測法的陽性率非常低，在本次研究中為8.33%（3／36）；被認為是結核病臨床診斷“金標準”的結核菌培養，因耗時長（6～8周）、陽性率低，而使其應用受到限制；且以上檢測均為侵襲有創性操作，意味著患兒需承擔相應痛苦及風險［6-7］?？梢娨陨戏椒▽τ诤Y選兒童骨關節結核病并不是最理想的選擇。

由于原有的結核診斷方法存在自身無法克服的缺陷，T-SPOT.TB給現代臨床醫學帶來快速、特異、靈敏準確的結核感染診斷方法。目前，歐洲、加拿大、美國均已審批應用，成為替代診斷結核感染的最主要方法［8］。該方法的基本原理是：當體內曾經受到結核分枝桿菌抗原刺激而致敏的T淋巴細胞再次遇到同類抗原時能產生γ干擾素。通過進行T-SPOT.TB，從單細胞水平檢測分泌γ干擾素的細胞數目，準確判斷機體是否存在結核感染，輔助診斷結核病。

本研究TB-SPOT.TB陽性檢出率為75.00%，與我們之前系列研究中報告的82.5%接近［9］，且在不同年齡段、不同病變部位（脊柱／四肢關節）間陽性檢出率差異無統計學意義，體現出對診斷各年齡段及不同病變部位的兒童骨關節結核病均有良好的一致性。與上述傳統檢查相比，TB-SPOT.TB優勢體現在：①敏感度高，TB-SPOT.TB明顯優于抗酸染色、結核菌培養；②快速安全簡便，簡單的血液檢測，隔天即報告結果，可避免對患兒造成創傷，特別是在病灶取活檢困難或外科手術指征不充分時；③特異性好，TB-SPOT.TB利用了結核分枝桿菌所特有的抗原靶6和培養濾液蛋白作為抗原刺激誘發免疫應答反應，只針對結核分枝桿菌復合群敏感，對大多數環境分枝桿菌和卡介苗無交叉反應，而PPD是多種蛋白成分的混合物，其容易受到接種卡介苗和環境分枝桿菌感染的影響，診斷結核分枝桿菌感染和結核病特異性相對較低［10］。

綜上所述，T-SPOT.TB作為一種新的診斷技術，在兒童骨關節結核病的臨床診斷中具有較好的應用價值，有助于探索并建立診斷兒童骨關節結核病的新方案。

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