miR-34c對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期影響的實驗性研究

武震東，任洪波，孫志強，劉 斌，牛國棟，焦保華

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 石家莊050000；2.河北省邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 邯鄲056000）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種約22個核苷酸長度非編碼單鏈小RNA，其本身不具有翻譯蛋白質(zhì)的功能，通過與mRNA的3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）堿基序列互補配對在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。miRNA與mRNA能進(jìn)行完全或近乎完全的互補配對，誘導(dǎo)對mRNA的切割降解，而部分堿基配對則導(dǎo)致功能蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄抑制［1］。最近有報道m(xù)iRNA與腫瘤惡性程度及腫瘤患者的預(yù)后有密切關(guān)系［2］。亦有報道與正常組織比較，惡性腫瘤組 織 的 miRNA 異 常 表 達(dá)［3］。MicroRNA-34c（miR-34c）在膠質(zhì)瘤組織中廣泛低表達(dá)，且隨膠質(zhì)瘤級別的升高，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)顯著降低，miR-34c-3p和miR-34c-5p表達(dá)與膠質(zhì)瘤級別呈負(fù)相關(guān)。本研究為膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34c-3p和miR-34c-5p，上調(diào)其表達(dá)，檢測miR-34c對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡等生物學(xué)特性的影響，旨在為膠質(zhì)瘤的治療開拓新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。正常人膠質(zhì)細(xì)胞系HEB細(xì)胞購自中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U251用含10%胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）的 DMEM-F12培養(yǎng)基，U87和HEB用含10%FBS的DMEM-高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，將符合細(xì)胞計數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)24～48h后換液繼續(xù)培養(yǎng)，換液的時間由細(xì)胞貼壁情況而定。培養(yǎng)U251、U87、HEB細(xì)胞達(dá)到指數(shù)生長期進(jìn)行實驗。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將化學(xué)合成的miR-34c寡核苷酸轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞中，同時設(shè)立轉(zhuǎn)染非特異性寡核苷酸片段的陰性對照組，使miR-34c基因有效的過表達(dá)。將未轉(zhuǎn)染任何核苷酸鏈的膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞為空白組。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA 轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，用LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染miRNA（化學(xué)合成的成熟miRNA模擬物mimics濃度為50nmol／L）到細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染時使用Opti-MEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后4h換為細(xì)胞生長培養(yǎng)基（U251用含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基，U87和HEB用含10%FBS的DMEM-高糖培養(yǎng)基）。

1.2.3 定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效果 利用RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen，USA）提取收集細(xì)胞總RNA。取1μg總RNA做莖環(huán)引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。miR-34c-3p和miR-34c-5p的共同逆轉(zhuǎn)錄引物為miRNA R：5′CTCAACTGGTGTCGTGGA。PCR引物為 hsa-miR-34c-3p F：5′ACACTCCAGCTGGGAATCACTAACCACACGG；hsa-miR-34c-5p F：5′ACACTCCAGCTGGGAGGCAGTGTAGTTAGCTGAT。內(nèi)參U6的引物為U6-F：5′CTCGCTTCGGCAGCACA；U6-R：5′AACGCTTCACG-AATTTGCGT。所有引物均為上海生工生物工程公司合成。使用的定量PCR儀為ABI PRISM?7500Sequence Detection System。PCR擴(kuò)增程序如下：95℃變形5min，隨后95℃作用15s，65℃作用15s，72℃作用32s，共進(jìn)行40個循環(huán)，在溫度60～95℃進(jìn)行融解曲線分析，每個樣本重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞增殖-毒性檢測（Cell Counting Kit-8，CCK-8）法檢測細(xì)胞增殖能力 取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行下面實驗。吹打散細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個／mL，分到96孔板，每孔100μL，即每孔細(xì)胞為1×104個。等細(xì)胞半貼壁完全，收集各個時間點的細(xì)胞24、48、72、96h加入CCK-8溶液細(xì)胞增殖檢測試劑，比例為1∶10。即100μL培養(yǎng)液加入10μL檢測液。在孵育4h后，酶標(biāo)儀讀板光密度（optical delnsity，OD）490數(shù)據(jù)。細(xì)胞存活率＝OD轉(zhuǎn)染組／OD對照組。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后每樣收集1×106細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，加入預(yù)冷70%乙醇，于4℃固定過夜，或-20℃長期固定。離心收集細(xì)胞，以1mL的PBS洗細(xì)胞1次，加入500μL PBS含50μg／mL溴化丙錠（propidiumiodide，PI），100μg／mL核糖核酸酶A（Ribonuclease A，RNase A），0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），4℃避光孵育30min。以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測，一般計數(shù)2～3萬個細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞培養(yǎng)板中各組細(xì)胞的培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)移到15mL的錐形管中并置于冰上。用2mL PBS溶液輕輕潤洗培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞，去除PBS溶液，加入0.5mL 0.25%不含EDTA的胰酶孵育，直到顯微鏡下觀察到細(xì)胞開始從培養(yǎng)板壁脫落。輕輕連續(xù)拍打使細(xì)胞從培養(yǎng)板壁上完全脫落，將細(xì)胞輕輕重懸于預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液中使得其密度為1×106細(xì)胞／mL，將0.5 mL細(xì)胞懸液從細(xì)胞培養(yǎng)板中（5×105個細(xì)胞）轉(zhuǎn)移到1個干凈的離心管內(nèi)，加入1.25μL細(xì)胞凋亡檢測試劑Annexin V-FITC，室溫（18～24℃）避光反應(yīng)15min，室溫1 000g離心5min，去除上清，將細(xì)胞用0.5mL預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸，加入10μL PI，立即用流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析、LSD-t檢驗和重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 定量PCR檢測miR-34c-3p和miR-34c-5p的轉(zhuǎn)染效果 在U87和U251細(xì)胞系中，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)量要明顯小于正常膠質(zhì)細(xì)胞系HEB（圖1，2）。而轉(zhuǎn)染了 miR-34c-3p或 miR-34c-5p的U87和U251細(xì)胞，其miR-34c-3p的表達(dá)量明顯高于空白組（P＜0.05，圖1）和陰性對照（P＜0.05）。該結(jié)果確定了miRNA確實轉(zhuǎn)染成功。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-34c抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力在U251細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p后48、72、96h，細(xì)胞存活率顯著低于空白組（P＜0.05）和陰性對照組（P＜0.05）（圖3）。而在 U87細(xì)胞中情況有所不同，轉(zhuǎn)染miR-34c-3p后48、72、96h，細(xì)胞存活率顯著低于空白組（P＜0.05）和陰性對照組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染 miR-34c-5p后24、48、72、96h，細(xì)胞存活率顯著低于空白組（P＜0.05），而與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

2.3 轉(zhuǎn)染miRNA-34c后細(xì)胞周期的變化 在U251細(xì)胞中，空白組和陰性對照組細(xì)胞的G0／G1期分別占72.7%和73.44%，而轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其 G0／G1期分別降至44.24%和43.58%。而空白組和陰性對照組細(xì)胞的G2／M期分別僅占4.4%和4.31%，轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其G2／M期分別升至21.6%和21.83%。S期與G2／M期相似，轉(zhuǎn)染后所占比例上升（圖5）。在U87細(xì)胞中，空白組和陰性對照組細(xì)胞的G0／G1期分別占69.3%和75.62%，轉(zhuǎn)染miR-34c-3p后，其G0／G1期降至44.05%，而轉(zhuǎn)染miR-34c-5p卻不能影響G0／G1期（79.07%）?？瞻捉M和陰性對照組細(xì)胞的S期分別占20.66%和13.61%，轉(zhuǎn)染miR-34c-3p后，其S期升至48.83%，但轉(zhuǎn)染miR-34c-5p同樣不能影響S期（11.04%）。G2／M期在4組中所占比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5）。該實驗證實了U251細(xì)胞高表達(dá)miR-34c-3p或miR-34c-5p，U87細(xì)胞高表達(dá)miR-34c-3p可以導(dǎo)致細(xì)胞停滯在S期，同時降低了G0／G1期的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞周期的變化說明miR-34c可能通過抑制細(xì)胞周期中的某個通路以達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的目的。

2.4 轉(zhuǎn)染miRNA-34c后誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡

根據(jù)流式細(xì)胞儀的結(jié)果，Annexin V和PI雙陽性的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。在U251細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞在空白組和陰性對照組分別占6.57%和6.3%，而轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p后凋亡細(xì)胞所占比例上升分別占28.49%和28.14%。但是在U87細(xì)胞中有所不同，僅轉(zhuǎn)染miR-34c-3p后凋亡細(xì)胞數(shù)上升（3.56%），而空白組，陰性對照組和轉(zhuǎn)染miR-34c-5p組分別為1.53%，1.68%和1.91%（圖6）。

圖1 實時定量PCR檢測正常膠質(zhì)細(xì)胞系HEB、U251和U87細(xì)胞系中miR-34c-3p的表達(dá)＊P＜0.05為miR-34c-3p組與空白組比較 ＃P＜0.05為miR-34c-3p組與陰性對照組比較 △P＜0.05為空白組與HEB比較（LSD-t檢驗）

圖2 實時定量PCR檢測正常膠質(zhì)細(xì)胞系HEB、U251和U87細(xì)胞系中miR-34c-5p的表達(dá)＊P＜0.05為miR-34c-5p組與空白組比較 ＃P＜0.05為miR-34c-5p組與陰性對照組比較 △P＜0.05為空白組與HEB比較（LSD-t檢驗）

圖3 轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，U251細(xì)胞的生存率＊P＜0.05為轉(zhuǎn)染組與空白組比較 ＃P＜0.05為轉(zhuǎn)染組與陰性對照組比較（重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析）

圖4 轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，U87細(xì)胞的生存率＊P＜0.05為轉(zhuǎn)染組與空白組比較 ＃P＜0.05為轉(zhuǎn)染組與陰性對照組比較（重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析）

圖5 轉(zhuǎn)染miRNA-34c-3p或miR-34c-5p后，細(xì)胞的細(xì)胞周期情況A.U251細(xì)胞；B.U87細(xì)胞

圖6 轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，細(xì)胞的凋亡情況A.U251細(xì)胞；B.U87細(xì)胞

3 討 論

腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖、凋亡和分化失衡的結(jié)果。越來越多的研究證實許多miRNA具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活的作用，同時還有許多miRNA具有抑制細(xì)胞增殖和存活的作用，這兩類miRNA作為癌基因和抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用［4-5］。說明將miRNA作為腫瘤治療的靶標(biāo)是可行的。在近期的研究中，miR-34異常表達(dá)抑制細(xì)胞分化、克隆形成，使細(xì)胞周期阻滯在G1期［6-7］。并且，miR-34a的再表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡［8］。miR-34介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能夠被p53基因的失活所抑制。miR-34a靶向一些mRNA，如SIRT1（Sirtuin type 1）、Bcl-2（B-cell lymphoma-2）、N-myc、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1），抑制這些基因轉(zhuǎn)錄［6，9-10］。最近有報道，miR-34c能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖［11］。

惡性膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)常見的腫瘤。miR-34c在人類惡性膠質(zhì)瘤組織和多種細(xì)胞系中低表達(dá)。本研究利用多種細(xì)胞生物學(xué)方法，進(jìn)一步探討miR-34c對膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞系的生物學(xué)功能，以便為膠質(zhì)瘤的治療尋找新的靶標(biāo)。本研究首先檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，利用經(jīng)典的CCK-8實驗對細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了miR-34c-3p或miR-34c-5p的細(xì)胞能夠明顯減弱細(xì)胞的增殖，但U87細(xì)胞中miR-34c-5p與其陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，也就是說miR-34c-5p的抑制增殖作用比較弱，猜測在U87細(xì)胞中miR-34c-5p對細(xì)胞的抑制機制可能與miR-34c-3p有所不同。細(xì)胞周期是指一個母細(xì)胞分裂形成的細(xì)胞到下一次再分裂形成2個子細(xì)胞的時期，分為間期（G1、S、G2期）和有絲分裂期（M 期）。本研究采用流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p后細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的U251細(xì)胞多停滯在S期及G2／M期，而僅轉(zhuǎn)染了miR-34c-3p的U87細(xì)胞多停滯在S期，轉(zhuǎn)染了miR-34c-5p的U87細(xì)胞周期變化與空白組和陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明miR-34c-5p抑制U87細(xì)胞的機制與miR-34c-3p不同，這也進(jìn)一步佐證了細(xì)胞增殖能力的結(jié)果。凋亡細(xì)胞對所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料，如PI有抗染性，細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p的U251細(xì)胞的凋亡率明顯增高，而轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p的U87細(xì)胞凋亡率變化不大。

從體外實驗數(shù)據(jù)看出，miR-34c-3p和miR-34c-5p能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在S期及G2／M期，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，大膽推測miR-34c-3p和miR-34c-5p在膠質(zhì)瘤中扮演抑癌的角色，但miR-34c-3p與miR-34c-5p在不同細(xì)胞系中，影響細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期變化及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果有所不同，推測它們可能是通過不同靶點或機制起作用，有待于在以后的實驗中繼續(xù)探討miR-34c-3p和miR-34c-5p在膠質(zhì)瘤的作用機制。

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