電針“委中”穴對大鼠腰多裂肌損傷后的再生促進作用及對IGF-1表達的影響

彭園園 張莉 劉通 陳玉佩 葛東宇 毛穎秋

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·論著·

電針“委中”穴對大鼠腰多裂肌損傷后的再生促進作用及對IGF-1表達的影響

彭園園 張莉 劉通 陳玉佩 葛東宇 毛穎秋

目的 觀察電針委中穴對腰部多裂肌損傷后的干預作用及對胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)表達的影響，探求委中穴對大鼠腰肌損傷后再生修復的可能機制。方法 雄性SD大鼠120只，隨機分為空白組、模型對照組、模型組、電針委中組、電針腎俞組，共5組，觀察3個時間點(4天、7天、14天)的變化，每個時間點8個樣本。 將0.5%布比卡因鹽酸鹽溶液按每點100 μL注射于模型組和電針組大鼠L4、L5水平的多裂肌上。模型對照組采用同樣方法注射生理鹽水，空白組不做處理。造模后進行電針雙側委中穴或腎俞穴分別治療4天、7天、14天，HE染色觀察肌細胞形態學的改變，免疫組化方法檢測肌細胞IGF-1的表達。結果 造模前后多裂肌形態學改變顯著，損傷后第14天仍未完全恢復。電針委中組與電針腎俞組從形態學上優于模型組。第4、7天模型組多裂肌IGF-1的表達顯著高于空白組(P<0.01)；第4天電針委中組表達顯著高于模型組(P<0.01)，電針委中組表達高于電針腎俞組(P<0.05)，電針腎俞組表達高于模型組(P<0.05)，而在第14天，電針腎俞組表達顯著高于模型組與電針委中組(P<0.01)。結論 電針委中穴和電針腎俞穴均能夠促進大鼠腰多裂肌損傷后的再生，電針委中穴在肌肉損傷的早期效果顯著。

電針； 多裂肌損傷； 布比卡因； 委中； 腎俞； 胰島素樣生長因子1

位于腰部豎脊肌深面的多裂肌是穩定腰椎的“鋼索”。以多裂肌為代表的腰部骨骼肌功能紊亂或損傷可導致各種急慢性腰痛[1-2]。研究表明，急性或慢性腰痛患者其多裂肌的I型和II型纖維會發生異常改變并伴有脂肪浸潤或出現多裂肌的萎縮。L4、L5節段的多裂肌對脊柱的穩定性貢獻最高，達70%以上[3]。因此，多裂肌損傷后的修復尤為重要。四總穴歌中的“腰背委中求”是委中穴治療腰背部疾病存在獨特療效的臨床經驗總結，也體現了“經脈所過，主治所及”的取穴原則。胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1,IGF-1)可以促進肌衛星細胞的增殖，并且選擇性的表達生肌調節因子。IGF-1是目前確定的唯一一種既參與肌衛星細胞的增殖又參與肌母細胞分化的生長因子[4]。前期實驗證明電針委中穴能夠促進兔腰肌急性鈍挫傷后堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、結蛋白(desmin)以及細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的表達[5]。說明委中穴對腰肌急性鈍挫傷有促進再生修復的作用。本實驗進一步觀察電針委中穴對布比卡因所致大鼠腰多裂肌毒性損傷后的再生修復作用及對IGF-1表達的影響，進一步探求委中穴對腰部肌肉損傷后再生修復的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠120只，體重300～350 g。由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。分籠飼養，明暗周期12小時，自由飲食和飲水，環境溫度24℃，濕度40～50%，適應性飼養7天。大鼠按體重分層，隨機分為：空白組、模型對照組、模型組、電針委中組和電針腎俞組各24只，再隨機分為三個時間點4天、7天、14天，每組各8只。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 儀器 G6805-1電針治療儀(青島鑫升實業有限公司)； RM2235石蠟切片機(德國LEICA公司)； DH-101電熱恒溫鼓風干燥箱(北京利康科技發展有限公司)；BX43顯微鏡(日本OLYMPUS公司)； Mshot MC50顯微成像系統(廣州市明美科技有限公司)。

1.2.2 試劑 布比卡因鹽酸鹽(美國sigma-FLUKA公司，生產批號：B5274-1G)；IGF-1抗體(美國millipore公司，生產批號：05-172)；小鼠超敏二步法檢測試劑盒(中杉金橋，生產批號：PV-9002)。

1.3 模型的建立和處理方法

1.3.1 造模 模型組和電針組大鼠10%水合氯醛腹腔注射(350 mg/kg)麻醉后，選擇雙側脊柱L4、L5水平兩旁的4個點，使用一次性4號針頭注射器抽取0.5%布比卡因溶液，針頭緊貼棘突旁進入肌肉，直到接觸關節突和乳突所在的骨面回抽套管1mm無血，表明針頭已到達多裂肌后注射布比卡因溶液400 μL(100 μL×4)，時間不得小于3秒，以利于藥物的吸收[6]，單次造模完成。模型對照組采用同樣辦法注射生理鹽水。

1.3.2 處理方法 電針委中組和電針腎俞組從造模后的第2天開始干預，將大鼠固定在特制的固定器上，分別暴露后肢和背部。采用華佗牌0.30×13 mm一次性針灸針，直刺進針后連接電針儀，頻率2/10 Hz 疏密波，電流1～2 mA，持續20分鐘，每天1 次，直至取材前1天。參照《實驗針灸學》[7]常用實驗動物穴位圖譜，分別選取雙側“委中穴”(膝關節背面正中)和雙側“腎俞穴”(第2腰椎旁開7 mm)。

1.4 取材

分別在造模后的第4天、7天、14天每組同步取材8只。10%水合氯醛腹腔注射(350 mg/kg)麻醉后，剔除背部皮毛、筋膜，充分暴露腰部肌肉，剝離開最長肌和髂肋肌，銳性切取L4和L5水平多裂肌組織，置4%多聚甲醛溶液中固定。

1.5 指標檢測

1.5.1 HE染色 4%多聚甲醛溶液固定48小時以上，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察形態學變化。

1.5.2 免疫組化染色 將切片60℃ 烤片2小時，常規二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，熱修復抗原，PBS沖洗，過氧化氫封閉10分鐘，滴加一抗，4℃孵育16小時，加二抗，DAB顯色，顯微鏡下觀察，出現棕黃色后即把切片放入自來水沖洗終止反應。脫水透明，中性樹膠封片。利用無偏體視學技術，光鏡下(400×)全視野無偏采樣方法每張切片選取3個視野，采用image-professional plus 6.0軟件進行圖像分析，測量每個視野中IGF-1陽性表達區域的平均光密度值(mean optical density，MOD)，取平均值為該樣本MOD值。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 組織形態學變化

如圖1 所示：空白組和模型對照組多裂肌HE染色：肌細胞呈細長纖維狀，排列整齊，細胞核均勻的分布在細胞周圍。模型組：造模后第4天可見肌纖維廣泛變性壞死，此時，大部分壞死的肌纖維已被巨噬細胞吞噬，壞死區可偶見散在的未受損纖維束，電針委中組和電針腎俞組可見少量的新生幼稚纖維。至第7天，出現更多的新生紅色肌纖維，且直徑變大；委中組較腎俞組可見較多的紅色新生條狀纖維。至第14天，新生的肌纖維已接近正常肌纖維的形態，平行排列，部分中央核開始向細胞周圍遷移分化為成熟的肌纖維。由圖可見，在同一時間內，電針委中組與電針腎俞組的肌纖維再生程度優于模型組，尤其是電針委中組。從形態學上說明電針委中/腎俞可加快肌細胞的再生。

2.2 免疫組化IGF-1的表達

如圖2 所示：空白組與模型對照組IGF-1幾乎無表達，略高于背景，分布較均勻。造模后第4天各組均可見IGF-1強陽性表達，從圖2(D)可見左側未損傷肌細胞(uninjured muscle, UM)著色淺，右側損傷肌細胞(injured muscle，IM)著色深。造模后7天，IGF-1仍然呈陽性表達，腎俞組略高于模型組合委中組。造模后14天，IGF-1陽性表達減少。

圖像分析顯示，第4天、7天模型組多裂肌IGF-1的表達顯著高于空白組(P<0.01)。第4天電針委中組表達顯著高于模型組(P<0.01)，電針委中組表達高于電針腎俞組(P<0.05)，電針腎俞組高于模型組(P<0.05)。第7天，模型組、電針委中組、電針腎俞組之間均無統計學意義，但腎俞組已表現出高于其他兩組的趨勢。第14天，電針腎俞組表達顯著高于模型組與電針委中組(P<0.01)，見表1。

A：正常組；B：模型對照組；C：模型組4d；D：電針委中組4d；E：電針腎俞組4d；F：模型組7d；G：電針委中組7d；H：電針腎俞組7d；I：模型組14d；J：電針委中組14d；K：電針腎俞組14d圖1 不同時間點各組大鼠腰部多裂肌HE染色

A：正常組；B：模型對照組；C：模型組4d；D：電針委中組4d；E：電針腎俞組4d；F：模型組7d；G：電針委中組7d；H：電針腎俞組7d；I：模型組14d；J：電針委中組14d；K：電針腎俞組14d。 UM：未受損纖維；IM：受損纖維。圖2 不同時間點各組大鼠腰多裂肌IGF-1的表達

組別4d7d14d空白組(n=8)0.019±0.0070.017±0.0090.020±0.003模型對照組(n=8)0.022±0.0050.021±0.0080.015±0.005模型組(n=8)0.158±0.061b0.089±0.021b0.039±0.030a電針委中組(n=8)0.263±0.047bde0.092±0.029b0.043±0.025b電針腎俞組(n=8)0.203±0.027bc0.107±0.015b0.079±0.010bdf

注：與空白組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01；與電針腎俞組比較，eP<0.05；與電針委中組比較，fP<0.01。

3 討論

全球約9.2%的人群受腰痛影響[8]，其中90%的腰痛患者為非特異性腰痛[9]，椎間盤源性腰痛占非特異性腰痛中絕大多數。脊柱及椎間盤的不穩定是導致間盤源性腰痛的主要因素，而多裂肌是穩定脊柱的重要肌群。臨床研究中發現很多急慢性腰痛患者均存在多裂肌功能異常或萎縮或伴有脂肪浸潤[3-5]。因此多裂肌損傷后的再生修復非常關鍵。胰島素生長因子(insulin-like growth factors ，IGFs)是肌肉再生和分化的關鍵生長因子。IGF-1可以促進肌衛星細胞的增殖，并且選擇性的表達生肌調節因子。布比卡因引起肌肉損傷后，在修復的初期伴隨IGF-1的自分泌并且調控MyoD的表達和肌衛星細胞的激活[10]。因此，IGF-1在肌肉再生中發揮非常重要的作用。

針刺在治療運動系統疾病療效肯定，也是國內外針刺研究者的主要研究方向之一。電針療法是針刺治療骨骼肌損傷研究中最常用的一種干預方法。臨床和實驗室研究表明，電針在治療骨骼肌損傷能通過多種途徑取得療效[11-15]。委中穴是治療腰背部疾患的通用穴，它被高頻次的應用于臨床[16-17]，或是單穴應用或是眾穴協同均效驗，“腰背委中求”是委中穴治療腰背部疾病存在獨特療效的臨床經驗總結。腎俞穴是治療腰部疾病的另一常用穴[18]，腰為腎之府，又為局部取穴，可疏通局部氣血。本研究結果顯示，布比卡因引起多裂肌損傷后會使得IGF-1表達上調，電針委中穴和電針腎俞穴均能使IGF-1的表達增加。值得提出的是，在損傷早期(第4天)電針委中組IGF-1的表達高于電針腎俞組。隨后兩組IGF-1的表達均下降，但仍高于模型組。至第7天時兩組表達無差異，甚至出現腎俞組高于委中組的趨勢，到損傷的中后期時(第14天)電針腎俞組的表達卻顯著高于委中組。說明電針委中穴可在肌肉損傷的早期起到較好的作用，腎俞穴在肌肉再生的中后期仍然有效。即委中穴起效快而腎俞穴作用更持久。從形態學恢復上亦是如此。

委中穴治療腰背痛多以急性為主如急性腰扭傷、脊柱強直、坐骨神經痛、腰椎間盤突出癥等，另外亦可治療、高熱抽搐、急性吐瀉等急癥[19]。也有研究表明針刺或刮痧委中穴可使同側腰部膀胱經皮膚血流量即刻升高[20-21]。而腎俞穴多以治療慢性疾病為主如慢性腰肌勞損，腎虛腰痛、慢性疲勞綜合征等[22]。由此可見，本實驗研究結果與中醫傳統理論以及臨床實踐具有一致性。

布比卡因引起的骨骼肌損傷初期伴有IGF-1的表達并激活肌衛星細胞進行增殖分化，從而進行骨骼肌的再生。電針委中穴能夠明顯改善大鼠腰多裂肌損傷后的組織形態學變化并增加生長因子IGF-1的表達，尤其是在肌肉損傷的早期，其作用優于電針腎俞組。

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(本文編輯：韓虹娟)

Effect of electroacupuncture at BL40 on morphology repairment and IGF-1 expression in rats with multifidus muscle injury

PENGYuan-yuan,ZHANGLi,LIUTong,etal.

SchoolofAcupunture-moxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

ZHANGLi,E-mail:zhangli1572@sina.com

Objective To observe the effect of electroacupuncture on multifidus musle injury by morphological observation and insulin like growth factor 1(IGF-1) expression of rats with bupivacaine induced multifidus muscle toxicity, and discuss the possible mechanism of muscle tissue regeneration. Methods 120 male Sprague Dawley rats were randomly divided into blank group (BG), model control group(CG), model group (MG),Weizhong(BL40) electroacupuncture group (WG) andShenshu(BL23) electro-acupuncture group (SG), each group then was divided evenly into three time points (day4, day7 and day14) and each time point has 8 samples. Multifidus muscle (L4 and L5 sections) toxicity was established by injecting 0.5% bupivacaine hydrochloride, and normal saline injection as control (CG). The WG and LG accepted electro-acupuncture for 4d, 7d or 14d after modeling. The multifidus muscle of each rodent was stained with HE to observe pathological changes, and immune-histochemical staining was used to observe IGF-1 expression. Results Bupivacaine caused a process of degeneration-regeneration of the muscle fibers and did not normalize at day 14. WG and SG were recovered faster than MG. The expression of IGF-1 at day 4 ranked as MG higher than BG (P<0.01), WG higher than MG and SG (P<0.01,P<0.05), and SG higher than MG (P<0.05), while ranked as SG higher than MG and WG (P<0.01) at day14. Conclusion Electro-acupuncture at both BL40 and BL23 could promote the regeneration of tissue after multifidus muscle injury, and it seems better therapy effect when electro-acupuncture at BL40.

Electro-acupuncture;Multifidus muscle injury;Bupivacaine;BL40; BL23;IGF-1

國家自然科學基金(81141120)

100029，北京中醫藥大學針灸推拿學院[彭園園(碩士研究生)、張莉、劉通(博士研究生)、陳玉佩(碩士研究生)]，基礎醫學院(葛東宇)，科研實驗中心(毛穎秋)

彭園園(1988- )，女，2012級在讀碩士研究生。研究方向：針灸臨床機理研究。E-mail：175808605@qq.com

張莉(1957- )，女，博士，博士生導師，教授。研究方向：針灸臨床機理研究。E-mail：zhangli1572@sina.com

R245

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.05.001

2014-12-18)