三七皂苷Rg1對肝纖維化大鼠線粒體質子跨膜轉運的作用機制

李劍瑜 劉鵬年 張霞 穆啟梅 高飛 甄敬輝 柳偉 石娜 武凡

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三七皂苷Rg1對肝纖維化大鼠線粒體質子跨膜轉運的作用機制

李劍瑜 劉鵬年 張霞 穆啟梅 高飛 甄敬輝 柳偉 石娜 武凡

目的 探討在三七皂苷(panax notoginseng saponins，PnS)Rg1干預下，肝纖維化大鼠線粒體質子跨膜轉運的變化和肝線粒體膜的流動性的變化，為開發三七單體Rg1在臨床抗纖維化的應用提供詳盡的試驗依據和理論基礎。方法 72只Wistar大鼠隨機分為對照組、四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)肝纖維化大鼠模型組、PnS Rg1組各24只。除對照組外，其余2組用5% CCl4橄欖油按5 mL/kg灌胃制作肝纖維化大鼠模型。PnS Rg1組在每次CCl4灌胃同時腹腔注射PnS Rg1(5 mg/kg)用穩態熒光探針標記技術動態觀察肝纖維化大鼠線粒體質子跨膜轉運的變化，用熒光偏振法測定肝線粒體膜的流動性和膜的微黏度的改變。結果 (1)與對照組相比，肝纖維化模型組大鼠用單因素多組間方差分析，發現模型組大鼠質子跨膜轉運中，肝線粒體質子跨膜轉運能力顯著下降(P<0.01)。PnS Rg1組與對照組相比質子跨膜轉運的變化沒有顯著性意義(P>0.05)，與模型組相比，有顯著性差異(P<0.01)。(2)肝纖維化模型組大鼠用單因素多組間方差分析，與對照組相比，證實模型組大鼠線粒體膜的流動性顯著下降(P<0.01)，增加膜的微黏度(P<0.01)；而Rg1組與模型組相比增加線粒體膜的流動性(P<0.01)，降低膜的微黏度(P<0.01)。結論 肝纖維化大鼠肝線粒體質子跨膜轉運能力下降和線粒體膜的流動性顯著下降是導致肝纖維化的重要原因之一。PnS Rg1通過增加肝線粒體質子跨膜轉運能力和線粒體膜的流動性而防治肝纖維化的發生發展的。

肝纖維化； 線粒體； 質子跨膜轉運； 膜的流動性； 三七皂苷Rg1

肝纖維化是很多慢性肝病的共同的病理過程，Banasch[1]提出肝臟線粒體氧化磷酸化過程中，線粒體氧化磷酸化的改變是影響肝纖維化發生發展的重要因素。在氧化磷酸化過程中，質子跨膜轉運是線粒體磷酸化能量的基礎。在底物氧化還原能的驅動下，質子由基質轉運到線粒體內膜外側，形成質子電化學梯度。在此質子電化學梯度跨膜轉運的驅動下形成線粒體磷酸化。然而，在肝纖維化時線粒體質子跨膜轉運的情況如何，鮮見報道，線粒體膜流動性對肝纖維化的形成具有重要的作用，但對肝纖維化大鼠的線粒體膜流動性的研究還不夠深入。本實驗用生物化學和生物物理學的方法研究大鼠肝纖維化肝線粒體質子跨膜轉運變化和線粒體膜流動性及其機理。目前線粒體質子跨膜轉運和膜流動性的改變所導致肝纖維化尚無根本有效的治療方法，近年文獻提出三七皂苷對治療慢性肝病有一定療效[2]，但對三七皂苷抗纖維化機制的研究主要是探討三七皂苷并非單體，研究其對自由基和細胞因子的影響，其對肝纖維化線粒體的質子跨膜轉運和膜流動性的作用和機理目前鮮見報導。實驗用5% CCl4橄欖油溶液制作大鼠肝纖維化模型，從生物化學和生物物理學方面地深入地研究三七皂苷單體Rg1對肝纖維化大鼠線粒體質子跨膜轉運和膜流動性的作用及機理，為開發三七單體Rg1在臨床抗纖維化的應用提供詳盡的試驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

72只健康雄性Wistar大鼠，體質量(250±20)g，購自河北醫科大學實驗動物中心，合格證號：冀醫動字第04056號。

主要試劑：三七皂苷Rg1購自昆明植物研究所，Hepes、IV型膠原酶、胰蛋白酶抑制劑、Percoll、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(9-anmino-6-chloro-2-meto-acridine，ACMA)、NADH、琥珀酸鈉等均購于sigma公司。ATP購于Beckman Coulter inc。1，6-二苯基-1，3，5乙三稀(1，6-diphenyl -1，3，5，-hexatriene，DPH)購自瑞典Fluka公司。

1.2 動物模型復制

將72只大鼠隨機分為3組，每組24只，Ⅰ組PBS灌胃作為對照組，Ⅱ組用5%CCl4橄欖油按5 mL/kg灌胃，每2天1次，共15次，作為CCl4模型組，Ⅲ組在每次CCl4灌胃同時腹腔注射Rg1 5mg/kg為Rg1組。各組均以普通飼料喂養，配以5%酒精飲用水。每組于2周、3周和4周均有6只大鼠供作生物物理學等的研究用。

1.3 標本采集與測定方法

1.3.1 測定肝線粒體質子跨膜轉運 按差速離心法，參考文獻[3]制備肝線粒體，用Lowry法測定蛋白質含量。將制備的線粒體用SET液(含250 mmol/L蔗糖，2 mmol/L Tris-HCl pH 7.4)放置-20℃儲存。

采用ACMA標記法，反應緩沖液2 mL(含250 mmol/L KCl、75 mmol/L蔗糖、2 mmol/L MgSO4，30 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)中加入ACMA至終濃度分別為0.2 g/L和5 μmol/L。在RF-540熒光分光光度計上進行激發波長(EX)和發射波長(EM)掃描，選取最適EX和EM，讀取熒光強度值作為基線，迅速加入NADH或琥珀酸鈉至終濃度分別為0.5 mmol/L和10 mmol/L以測定呼吸鏈引起的跨膜H+梯度。測定ATP引起的跨膜H+轉運，先加入呼吸鏈阻斷劑氰化鉀(1 mmol/L)以阻斷細胞色素C到氧的電子傳遞，然后再加入ATP(1 mmol/L)，觀察并記錄其熒光強度隨時間的變化。以上均在30℃進行，狹縫10 nm，用穩態熒光探針標記技術動態觀察肝纖維化大鼠線粒體質子跨膜轉運的變化，最大熒光淬滅值，最大熒光淬滅時間和半數熒光淬滅時間。

1.3.2 線粒體膜流動性的測定 取新鮮肝組織，參考文獻[4]提取線粒體膜，采用熒光標記與熒光偏振法，以DPH作為熒光探針標記線粒體膜以測定線粒體膜的流動性，激發光波362 nm，發射光波長432 nm，在熒光分光光度計上(加偏振片)測定膜熒光偏振度(P)，按公式η=2p/0.46-P，求出平均微黏度。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 肝線粒體質子跨膜轉運的變化

熒光波長掃描ACMA熒光EX峰為400 nm，EM峰為480 nm。多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用SNK檢驗。與對照組相比，模型組大鼠線粒體在能量化(ATP)和底物NADH、琥珀酸鈉驅動下最大熒光淬滅值較對照組相比顯著減少(P<0.01)，最大熒光淬滅時間、半數熒光淬滅時間較對照組顯著延長(P<0.01)。PnS Rg1組與對照組相比，最大熒光淬滅值，最大熒光淬滅時間和半數熒光淬滅時間改變沒有顯著性意義(P>0.05)，說明質子跨膜轉運的變化沒有顯著性意義(P>0.05)，表明PnS Rg1對肝纖維化大鼠肝線粒體質子跨膜轉運能力有保護作用。見表1。

2.2 肝線粒體膜流動性的變化

多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用SNK檢驗，與對照組相比，模型組大鼠線粒體膜的流動性顯著下降(P<0.01)，膜的微黏度增加(P<0.01)，而Rg1組與模型組相比增加線粒體膜的流動性(P<0.01)，膜的微黏度下降(P<0.01)。見表2。

2.3 肝纖維化大鼠線粒體熒光淬滅值與肝線粒體膜熒光偏振度的相關性

檢測模型組大鼠在肝纖維化形成過程中各時相點的變化，與對照組相比，加入琥珀酸鈉后線粒體熒光淬滅值在第2周明顯下降，第3周就有明顯差異(P<0.05)，第4周有顯著性差異(P<0.01)。線粒體熒光淬滅值與肝線粒體膜熒光偏振度的相關性分析用pearson’s檢驗，r=-0.836，線粒體熒光淬滅值與肝線粒體膜熒光偏振度呈負相關。見表3。

表1 第4周各組大鼠肝線粒體熒光淬滅值的變化

表2 第4周各組大鼠肝線粒體膜熒光偏振度和微黏度的比較

表3 橫型組肝纖維化大鼠線粒體熒光淬滅值與熒光偏振度的相關性

3 討論

ATP酶由FOF1兩部分構成。FO是質子通道，當H+順濃度經FO回流時，催化ADP和Pi生成并釋放ATP線粒體呼吸鏈通過質子的跨膜轉運將底物氧化的化學能轉變為線粒體膜質子電化學梯度，以供ATP合成需要[5]。Huang等[6]認為早期線粒體氧供和氧耗發生改變是肝纖維化形成的主要原因。目前對肝線粒體氧化磷酸化的研究僅局限于測定線粒體氧耗和電子傳遞情況，對肝纖維化質子跨膜轉運線和粒體膜的流動性的情況鮮見文獻報道。

本實驗采用熒光偏振法，以DPH作為熒光探針標記線粒體膜以測定線粒體膜的流動性，熒光偏振大，膜流動性小；反之，熒光偏振大，膜流動性小。實驗檢測到模型組肝臟線粒體膜流動性明顯下降，其差異均有顯著性(P<0.01)，提示肝纖維化大鼠線粒體膜剛性增加，流動性下降，與模型組相比，三七皂苷Rg1組導致肝線粒體微黏度降低，膜流動性顯著增加(P<0.01)，保護了線粒體膜，加強線粒體的氧化磷酸化的功能，進一步產生ATP。

本實驗用生物化學和生物物理學的方法研究大鼠肝纖維化肝線粒體質子跨膜轉運變化和線粒體膜的流動性，首次發現肝纖維化時肝線粒體質子跨膜轉運能力明顯減弱，線粒體膜的熒光偏振度顯著增加，兩者具有負相關性，進一步探討其可能機制。前期工作已證實肝纖維化時自由基產生增多，分泌性磷脂酶A2增多，引起線粒體損傷[6]，本實驗證實肝纖維化肝線粒體質子跨膜轉運能力明顯減弱，線粒體膜的流動性顯著降低，導致氧化磷酸化解偶聯，不能合成ATP，因此肝纖維化引起線粒體氧化磷酸化作用受損，導致細胞內能量代謝障礙，加速肝纖維化的形成[7-8]。

線粒體質子跨膜轉運能力明顯減弱和線粒體膜的流動性顯著降低所影響和導致的疾病目前尚無根本有效的治療方法，基因治療帶來了希望，包括基因轉換、線粒體轉染、基因的靶向治療等，但由于這些基因片段本身存在細胞通透性、細胞毒性、代謝穩定性等方面的問題，因此臨床應用尚未有突破性進展[9]。本課題運用逆向思維，從療效入手，從臨床已經使用的藥物入手，來尋找防治肝纖維化線粒體損傷的抑制劑，選用三七皂苷Rg1作為研究對象。本實驗中證實三七皂苷Rg1具有保護大鼠肝線粒體內膜能量質子跨膜轉運以及呼吸鏈底物氧化引起的質子跨膜轉運能力，可導致肝線粒體微黏度降低，膜流動性顯著增加，P<0.01，保護了線粒體膜，加強線粒體的氧化磷酸化的功能，因此可使ATP的合成增加，維持肝細胞進行正常生理功能的能力，防治肝纖維化的產生，為開發三七皂苷單體Rg1在臨床抗肝纖維化的應用提供了詳盡的試驗依據和理論基礎。

[1] Banasch M，Ellrichmann M，Tannapfel A， et al. The non-invasive (13)C-methionine breath test detects hepatic mitochondrial dysfunction as a marker of disease activity in non-alcoholic steatohepatitis [J]. Eur J Med Res，2011，16(6):258-264.

[2] 武凡，李劍瑜，劉鵬年.三七皂苷Rg1、Rb1抗大鼠肝纖維化的作用及機制研究[J].河北醫藥，2013，35(18):2731-2734.

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[4] Parker N，Affourtit C，Vidal-Puig A，et al. Energization-dependent endogenous activation of proton conductance in skeletal muscle mitochondria[J].Biochem J，2008 ，412(1):131-139.

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(本文編輯：董歷華)

Action mechanism of proton translocation across mitochondrial membrane of notoginsenoside Rg1 on hepatic fibrosis rats

LIJian-yu,LIUPeng-nian,ZHANGXia,etal.

BloodTransfusionDepartmentofZhuozhouCityHospital,Zhuozhou072750,China

WUFan，E-mail:wufanfan49@163.com

Objective To investigate the changes in proton translocation across mitochondrial membrane and hepatic mitochondria membrane fluidity of rats with hepatic fibrosis under the intervention of notoginsenoside Rg1, in order to provide detailed experimental and theoretical basis for the clinical application of notoginsenoside Rg1. Methods 72 Wistar rats were randomly divided into control group, carbon tetrachloride (CCl4) group, model group and notoginsenoside Rg1 group, and with 24 rats in each group. All the rats received gavage administration with 5% CCl4solution (5 mL/kg) in addition to the control group, and rats in notoginsenoside Rg1 group received intraperitoneal injection with notoginsenoside Rg1 (5 mg/kg) based on the gavage administration. The change of proton translocation across mitochondrial membrane of rats with hepatic fibrosis was observed dynamically by using steady-state fluorescence probe technique. The change of hepatic mitochondria membrane fluidity and the viscosity of membrane were observed by using fluorescence polarization methods. Results (1)Compared with control group, the ability of proton-translocation across mitochondrial membrane in hepatic was declined significantly of rats in model group (P<0.01). There was no significant difference in ability of proton-translocation across mitochondrial membrane in hepatic of rats between control and notoginsenoside Rg1 groups (P>0.05), while the difference was significant between model and notoginsenoside Rg1 groups (P<0.01).(2)Compared with control group, the mitochondrial membrane fluidity of rats in model group was declined significantly (P<0.01), and the membrane viscosity was increased significantly (P<0.01). Compared with model group, the mitochondrial membrane fluidity of rats in notoginsenoside Rg1 group was increased (P<0.1), while the membrane viscosity was declined significantly (P<0.01). Conclusion One of the important causes of hepatic fibrosis rats was the decline in ability of proton-translocation across mitochondrial membrane and membrane fluidity in hepatic. Notoginsenoside Rg1 could prevent the occurrence and development of hepatic fibrosis through increasing the ability of proton-translocation across mitochondrial membrane and membrane fluidity of hepatic.

Hepatic fibrosis; Mitochondria; Proton-translocation across mitochondrial membrane; Mitochondrial membrane fluidity; Notoginsenoside Rg1

072750河北省涿州市醫院輸血科(李劍瑜、劉鵬年、張霞、穆啟梅、甄敬輝、柳偉、石娜)，CT室(高飛)，檢驗科(武凡)

李劍瑜(1973- )，女，本科，副主任技師。研究方向：臨床檢驗。 E-mail：ljy1797@163.com

武凡(1949- )，女，博士，教授。研究方向：細胞損傷與抗損傷。E-mail：wufanfan49@163.com

R285

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.05.003

2014-12-02)