艾煙與香煙對載脂蛋白E基因敲除小鼠學習記憶功能與海馬β淀粉樣蛋白沉淀的影響

劉鈞天 崔瑩雪 黃玉海 黃暢 黃劍 趙百孝 韓麗 楊佳 王磊

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艾煙與香煙對載脂蛋白E基因敲除小鼠學習記憶功能與海馬β淀粉樣蛋白沉淀的影響

劉鈞天 崔瑩雪 黃玉海 黃暢 黃劍 趙百孝 韓麗 楊佳 王磊

目的 觀察艾煙與香煙對載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-deficient，ApoE-/-)小鼠學習記憶能力與海馬β淀粉樣蛋白(β-Amyloid)沉淀的影響。方法 將13只8周齡C57BL/6小鼠作為空白對照組，27只同齡ApoE-/-小鼠隨機分為ApoE-/-模型組、艾煙組、香煙組。香煙與艾煙組小鼠分別暴露于5～15 mg/m3的香煙與艾煙環境。各組小鼠每天干預20分鐘，每周6天，共干預12周。于第13周進行行為學測試，之后處死動物、取材，對其腦組織海馬中Aβ沉淀進行剛果紅染色。結果 與模型組對比，空白對照組、艾煙組、香煙組小鼠均表現出學習潛伏期縮短，記憶潛伏期增長，記憶錯誤次數減少，差別有統計學意義(P<0.05)。模型組小鼠在視野范圍內有明顯的粉紅色彌散樣Aβ沉淀，空白對照組明顯少于模型組(P<0.05)。艾煙組與香煙組在相同海馬區域CA3中淀粉樣蛋白沉淀均有不同程度的減少,艾煙組中Aβ沉淀較模型組顯著降低(P<0.05)，較香煙組亦有減少(P<0.05)。結論 艾煙能夠發揮ApoE-/-小鼠的海馬CA3區保護作用，減少Aβ沉淀進而改善ApoE-/-小鼠學習記憶能力。

艾煙； 香煙； 載脂蛋白E基因敲除小鼠； 淀粉樣蛋白； 學習記憶

艾灸是以艾絨為施灸材料，點燃后在體表一定的部位進行燒、灼、熏，給人體以溫熱、藥物刺激作用，以防治疾病的一種外治法。艾煙作為艾灸的重要組成部分被證明有著諸多的生物活性——抗氧化[1-2]、廣譜殺菌、抗病毒[3-4]、抗腫瘤[5-6]以及免疫調節[7]等作用。課題組前期研究中發現艾煙可以提高人體自主神經活力[8]，改善SAMP8小鼠腦中氧化應激狀態[9]，說明艾煙可從多渠道參與改善衰老模型小鼠的病理進程。

為進一步觀察艾煙對阿茲海默病模型小鼠學習記憶功能以及腦中β淀粉樣蛋白(Aβ)沉淀形成的影響。本實驗以載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-deficient，ApoE-/-)小鼠為模型，通過對比觀察艾煙暴露與香煙暴露兩種不同干預方式對其學習記憶功能影響及腦組織海馬中Aβ沉淀改變，探討艾煙對腦組織衰老的干預作用，以期為探索艾灸療法延緩衰老機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用清潔級8周齡雄性載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)27只，C57BL/6小鼠13只，體質量30 g，2013年3月22日購自北京大學動物醫學中心[許可證：SCXK(京)2011-0012]。ApoE-/-小鼠采用高脂飼料喂養，C57BL/6小鼠采用標準飼料喂養，自由進水；飼養環境溫度(22±2)℃，相對濕度50%～60%，保持12小時光照(8∶00～20∶00)和黑暗(20∶00～次日8∶00)交替循環。

小鼠購進后，適應性飼養1周，干預12周。按隨機數字表法將ApoE-/-小鼠隨機分為ApoE-/-模型組、艾煙組、香煙組三組(每組9只)，并將13只C57BL/6小鼠作為空白對照組進行對照。

1.2 主要實驗材料、儀器及試劑

自制細艾條：(直徑0.5 cm×長20 cm，河南南陽漢醫艾絨有限公司)；香煙(中南海牌，焦油含量10 mg/支)；自制帶孔玻璃缸1 m×1 m×1 m,頂層玻璃正中設一直徑5 mm圓孔)； 光散射式數字粉塵測試儀(北京賓達綠創科技有限公司)；小鼠跳臺試驗儀；剛果紅染液(南京建成生物工程研究所)；中性樹膠封片劑；多聚甲醛，中性樹膠及其它生物試劑(Sigma公司)。

1.3 實驗步驟

空白暴露：將空白對照組與ApoE-/-模型組小鼠分別暴露于玻璃缸中20分鐘。

艾煙干預：將調試好的粉塵測試儀置于玻璃缸中間，將艾煙組小鼠自由暴露在玻璃缸中，點燃自制細艾條，從玻璃缸上方的圓孔將點燃的一端插入，令艾煙充滿玻璃缸。根據前期實驗結論[10]，控制艾煙濃度為5～15 mg/m3。用粉塵測試儀測試其濃度達到預定范圍后(此過程艾條燃燒約15秒)，將艾條取出，迅速封閉圓孔。此后每隔3分鐘記錄一次濃度數值，使濃度穩定在10 mg/m3左右。若數值高于15 mg/m3，可將上方玻璃蓋稍微移動，令艾煙散去部分后迅速將蓋子移回；若數值低于5 mg/m3，可再將點燃的艾條由圓孔插入，以補充艾煙。20分鐘后，取出小鼠，每周干預6天，共干預12周。

香煙干預：除將艾條換成香煙，香煙濃度及干預方式與艾煙組相同。在進行香煙干預時要保證與其他組別嚴格隔離，避免其他組別嗅到香煙。

于第13周進行跳臺試驗。將小鼠置于被動回避反應箱(20 cm×20 cm×10 cm)，適應3分鐘，然后底部銅柵通電(AC，40V)，通電時間5分鐘。小鼠遭受電擊后，會跳上絕緣墊躲避電擊；當從安全臺上跳下觸及電柵遭受電擊即為錯誤反應，記錄小鼠首次跳上絕緣墊所需時間即反應時間，5分鐘內跳下圓臺次數(錯誤次數)，作為學習成績。24小時后重復上述測試，記錄小鼠首次從安全臺跳至銅柵所需時間即潛伏時間、5分鐘內跳下圓臺次數(錯誤次數)，作為記憶成績。

1.4 取材方法與標本制備

隨機選取6只，用10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠，以4%多聚甲醛頸動脈灌注法固定腦組織，靜置30分鐘后開顱取腦，置4%多聚甲醛中固定過夜，流水沖洗30分鐘，用各級乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，常規包塊。轉化切片機切片，制備腦冠狀面切片，片厚約6 μm。取等間隔的組織切片采用剛果紅染色[11]：切片脫臘脫水，甲醇剛果紅染液浸染10～20分鐘，用堿性乙醇分化液分化10秒，蒸餾水洗3分鐘，95%乙醇沖30秒；無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光鏡下(×400)選取細胞數較為恒定的CA3區拍片，比較不同組小鼠的Aβ斑變化。

1.5 統計學方法

所有數據應用SPSS 19.0統計軟件進行分析。跳臺試驗中學習潛伏期、學習錯誤次數、記憶潛伏期與淀粉樣蛋白陽性面積各數據呈現正態分布以均數±標準差表示，符合方差齊性，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行各組之間比較，LSD、SNK進行兩兩比較,記憶錯誤次數不符合正態分布以中位數(四分位距)表示，以非參數檢驗經行各組之間比較，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組小鼠學習成績與記憶成績對比

學習潛伏期中空白組反應時間最短，模型組反應時間最長，各組之間比較具有統計學差異(F=10.574，P=0.000<0.01)。與模型組相比，空白組(P=0.000<0.01)、艾煙組(P=0.000<0.01)、香煙組(P=0.006<0.01)反應時間較短，均有統計學差異。艾煙組與香煙組無差別。學習錯誤次數各組之間無統計學差別。

記憶潛伏期中艾煙組記憶時間最長，模型組記憶時間最短。各組間比較有統計學差異(F=16.227，P=0.000<0.01)。與模型組相比，空白組(P=0.000<0.05)、艾煙組(P=0.000<0.01)、香煙組(P=0.011<0.05)反應時間顯著延長，有統計學差異。艾煙組與香煙組無差別。記憶錯誤次數以模型組最多，空白組與艾煙香煙組中位數均為0低于模型組，并具有統計學差異(P<0.05)。說明艾煙與艾灸可降低ApoE-/-小鼠學習記憶能力減低程度，見表1。

表1 各組小鼠跳臺試驗結果

注：與模型組比較aP<0.05，bP<0.01。

2.2 各組小鼠海馬Aβ沉淀

經剛果紅染色的ApoE-/-小鼠海馬CA3區在高倍光學顯微鏡下觀察(圖1)，模型組小鼠在視野范圍內有明顯的粉紅色彌散樣Aβ沉淀(如圖1中箭頭所示)，而空白組小鼠切片在同樣部位未顯現出淀粉樣變，Aβ面積以模型組最高，空白組最低。空白組明顯低于模型組(P=0.00<0.05)(見表2),說明造模成功。ApoE-/-小鼠經過12周艾煙與香煙治療后，艾煙組與香煙組在相同海馬區域CA3中Aβ沉淀均有不同程度的減少,艾煙組中Aβ沉淀較模型組顯著降低(P=0.004<0.05)，較香煙組亦有減少(P=0.022<0.05)。說明艾煙可以減少ApoE-/-小鼠海馬Aβ沉淀。

A：空白組；B：模型組；C：艾煙組；D：香煙組注：箭頭所示為海馬中彌散的粉紅色Aβ淀粉樣沉淀。圖1 各組小鼠海馬CA3區經剛果紅染色后淀粉樣蛋白沉淀情況(×400)

組別n淀粉樣蛋白陽性面積(μm2)空白組6101.25±82.68a模型組637661.70±12349.53香煙組635455.84±18836.45艾煙組64034.43±1992.05ab

注：與模型組比較aP<0.01，與香煙組比較bP<0.01。

3 討論

現代研究證明ApoE基因與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、阿茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)等血管疾患及中樞神經系統(central nervous system，CNS)功能障礙有關。在心血管系統中，ApoE基因缺失可導致高脂血癥并逐步演化為AS；在CNS內，ApoE由星形膠質細胞合成并分泌，參與維護膽固醇、磷脂的動態平衡，調節神經膜重塑時膽固醇與磷脂的動員與再分布，從而參與調節突觸可塑性的維護以及神經細胞受損時的修復[12]。因此，載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠除了應用在動脈粥樣硬化癥的研究中，還作為一種新型動物模型應用于認知障礙發生機制的研究中[13]。

在ApoE基因的三個亞型中ApoE4被證明與阿茲海默病有著最為密切的關系，它主要通過影響腦血管系統導致諸如Aβ沉淀等神經毒素的累積[14]。1991年，Namba等人發現,在Aβ沉積和神經原纖維中,可以檢測到ApoE蛋白成分,進一步研究證實ApoE蛋白能夠和Aβ形成前沉積樣顆粒[15]。本實驗結果表明，模型組較空白組學習記憶能力差，其海馬Aβ沉淀面積顯著高于空白組，證實了ApoE-/-小鼠可以產生類似阿茨海默病的腦部病理表現，說明此小鼠模型應用于認知功能障礙的研究是切實可行的。產生這種病理改變的原因很可能是由于ApoE基因的缺失，使得淀粉前體蛋白的分裂增加，導致Aβ沉積異常增多[14-16]。

艾煙與香煙雖然都是常見的可吸入煙霧，但其安全性卻相去甚遠。香煙煙霧成分復雜，其中很多化合物具有致畸、致突變的作用[17]。流行病學調查發現，吸煙會導致呼吸系統、心血管系統發病率的提高。不同于香煙煙霧，本課題組在前期對艾煙安全性研究中發現臨床濃度下的艾煙煙霧不會對呼吸、心血管等系統臟器產生毒性影響，且不會引起全身過敏反應[18]，初步證實了艾煙的安全性。

艾煙作為艾灸過程中的燃燒生成物，其主要成分與生物活性都影響著艾灸療效的發揮。在課題組前期利用氣相色譜—質譜技術對艾燃燒生成物進行分析[19]，結果共得到85種不同的化學成分，其中大部分為芳烴、萜類和一些長鏈脂肪烴，而其揮發油成分則鑒定出26種[20]。艾煙作為具有獨特氣味的煙氣，其作用途徑很可能通過嗅覺。艾煙中多種氣味化合物與特異受體結合激活氣味受體細胞并產生電信號，通過特異性的嗅覺通路將嗅覺信息投射到下丘腦、邊緣系統、海馬等部位，直接參與情緒與學習記憶等行為的調控[21-22]。在艾煙生物活性研究中，發現艾煙不僅可以降低wistar大鼠血清中氧化修飾低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)和血管性假血友病因子水平，升高低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDL-r)，從而對脂質代謝產生良性調整作用[23]；還可通過提高快速老化小鼠系8(senescence-accelerated mouse prone 8，SAM-P8)小鼠腦中抗氧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，調節Th1/Th2細胞因子平衡[10]，起到調節免疫和抗氧化的作用。吸煙可以引起肺癌與呼吸道損傷，但其主要毒性物質尼古丁卻被報道其具有改善AD小鼠學習記憶行為的作用[24]。本次實驗結果顯示，艾煙與香煙均能不同程度的改善ApoE-/-小鼠的學習記憶功能，艾煙組海馬中Aβ沉淀顯著低于模型組與香煙組，說明艾煙可減少ApoE-/-小鼠腦中Aβ沉淀，其作用途徑可能是通過艾煙本身的活性成分經黏膜吸收與干預嗅覺系統的神經遞質，影響嗅覺傳導的信號改變，調節脂質代謝，改善腦內Aβ沉積與清除之間的失衡，進而抑制Aβ沉淀的累積。

實驗結果再次證明了ApoE-/-小鼠可以作為阿茨海默病的動物模型。并說明艾煙的確可以降低ApoE-/-小鼠的腦內淀粉蛋白沉淀，改善學習記憶功能進而起到延緩腦組織衰老的作用。

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(本文編輯：董歷華)

Effects of moxa and cigarette smoke on behavioral changes and brain β amyloid deposition in apolipoprotein E-deficient mice

LIUJun-tian，CUIYing-xue，HUANGYu-hai，etal.

CollegeofAcumoxandTuina，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

ZHAOBai-xiao，Email：baixiao100@gmail.com

Objective To investigate the influence of moxa smoke and cigarette smoke on the apolipoprotein E-deficient (ApoE-/-) male mice’ learning and memory ability and β amyloid deposition in brain hippocampus. Method 13 eight weeks old C57BL/6 mice were assigned to control group; 27 eight weeks old ApoE-/-mice were randomly divided into 3 groups (n=9/group): model group, moxa smoke group, cigarette smoke group. Mice in the two smoke groups were exposed to smoke, which concentration is controlled within 5～15 mg/m3; mice in model group and control group were exposed to normal air. The step-down test was conducted in the 13th week. Level of β amyloid deposition was determined by congo red staining. Results Compared with the model group, mice in control group, moxa smoke group and cigarette smoke group showed decreased learning latency, increased memory latency and made less mistakes in the step-down test (P< 0.05). Compared with the model group, β amyloid deposition of control group, moxa smoke group and cigarette smoke group was significantly decreased (P< 0.05). Conclusion Our findings suggest that moxa smoke may have effect on protecting nerve function and anti-aging by reducing the deposition of β amyloid in hippocampus.

Moxa smoke； Cigarette smoke； Apolipoprotein E-deficient mice； Amyloid； Step-down test

國家自然科學基金面上項目(81373730)；北京中醫藥大學自主課題(0100604214，0100605132)

100029 北京中醫藥大學針灸推拿學院[劉鈞天(博士研究生)、黃玉海(碩士研究生)、黃暢(博士研究生)、黃劍(博士研究生)、趙百孝、韓麗、楊佳(博士研究生)、王磊(博士研究生)]；北京中醫醫院針灸科(崔瑩雪)

劉鈞天(1986- )，女，2012級在讀博士研究生。研究方向：艾灸作用原理研究。E-mail:juntianyt@hotmail.com

趙百孝(1963- )，博士，教授。研究方向：針灸作用原理與艾灸效應機制研究。 E-mail:baixiao100@gmail.com

R245.81

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.05.004

2014-09-02)