小麥根際土壤中禾谷多黏菌實時熒光定量PCR檢測體系的建立及應用

王燕霞， 吳季榮， 俞明正， 趙晶晶， 邢宇俊， 徐劍宏， 史建榮

(1.南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210046;2.江蘇省農業科學院食品質量與安全檢測研究所，江蘇 南京 210014;3.江蘇轉基因安全評價公共技術服務中心，江蘇 南京 210014)

自1983年第一例轉基因煙草誕生以來［1］，轉基因作物便得到了迅猛的發展，商業化種植面積也從1996年的 1.70×106hm2增長到了 2014年的1.815 ×108hm2［2］。轉基因作物給人類社會帶來巨大經濟效益的同時，其對生態環境存在的潛在威脅也成為人們越來越關注的話題。目前，國內外對轉基因作物的研究主要集中在轉Bt基因的水稻、棉花、玉米和馬鈴薯上［2-6］。其研究內容也多以轉基因作物對其根際土壤中微生物的群落結構及主要酶活性的影響為主［7-9］，而對轉基因抗病小麥根際土壤中微生物數量的研究則比較少。

禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)是一種專性寄生于植物根部的根腫菌目真核生物，最初在小麥中發現，而后又相繼在其他谷類作物中發現。禾谷多黏菌本身無害，但其可通過孢子傳播大麥黃花葉病毒(Barley yellow mosaic virus，BaYMV)、大麥和性花葉病毒(Barley mild mosaic virus，BaYMMV)、小麥梭條花葉病毒(Wheat spindle streak mosaic virus，WSSMV)以及小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic virus，WYMV)，進而使寄主染病［10-11］。因此，禾谷多黏菌數量的變化可以作為評價土壤環境的一項指標。

轉基因小麥N12-1轉入了小麥黃花葉病毒的復制酶基因WYMV-Nib8，對小麥黃花葉病具有顯著的抗性［12-13］。本研究擬建立基于實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR)方法檢測禾谷多黏菌數量的體系，并將該體系應用于轉基因小麥N12-1及其受體小麥揚麥158不同生長期根際土壤中禾谷多黏菌數量的檢測，以期為研究轉基因作物對土壤微生物生態系統的影響提供一定的技術參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

轉WYMV-Nib8基因小麥N12-1及其受體小麥揚麥158，其中N12-1由中國農業科學院提供。

1.2 方法

1.2.1 田間設計 大田試驗于2013年10月—2014年6月在江蘇省農業科學院轉基因作物實驗基地(六合)進行。每個品種種植4個小區，隨機區組。每個小區長10 m，寬6 m。小麥按行播種，行長6 m，行距30 cm，株距3 cm。

1.2.2 土壤樣品的采集 分別在小麥生長的播種期、苗期、返青期、抽穗期、灌漿期以及成熟期采集根際土壤樣品。每個小區采取“W”型五點取樣法，采集小麥根際土壤樣品。采樣點經GPS定位后，設為固定采樣點。將從5個點采集的土樣混合成一個重復，新鮮土樣經20目篩后，用小自封袋收集，4℃保存，備用。

1.2.3 土壤總DNA的提取 稱取0.500 g土壤樣品，利用Ultra CleanTMsoil DNA isolation kit(MoBio，USA)試劑盒，根據操作步驟進行土壤總DNA的提取。最后將其溶于50μl ddH2O中，－20℃保存，備用。

1.2.4 禾谷多黏菌標準質粒的制備 在NCBI中篩選出多個禾谷多黏菌核糖體DNA(rDNA)序列，通過序列分析，在其相對于其他菌的rDNA保守區域設計1對特異性引物Pg-F(5'-CTGCGGAAGGATCATTAGCGTTG-3')和 Pg-R(5'-CCGATACTCAGAGAGGCATGCT-3')。利用上述引物對土壤總DNA中的目的片段進行PCR擴增。PCR反應體系為25.0 μl，其中包括 rTaq酶 0.125 μl，10 ×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 2.0 μl，MgCl21.5 μl，上下游引物各1.0μl，模板1.0μl。反應條件為:94℃預變性4 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環;72℃延伸10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將特異條帶切膠回收。回收產物連接到載體pMD19-T(TaKaRa公司產品)上，并通過熱激法轉化到大腸桿菌感受態細胞DH5α。將其涂布在氨芐抗性平板上，37℃過夜篩選。PCR鑒定呈陽性的克隆送至上海生工生物工程有限公司進行測序。將測序結果呈陽性的克隆進行擴大培養，并提取質粒。經微量紫外分光光度計測定濃度后，計算拷貝數。質粒拷貝數=質粒濃度×6.023×1023/MW，式中MW=(克隆載體長度+目的片段長度)×324×2，質粒濃度的單位為 g/μl，MW 單位為g/mol，克隆載體長度和目的片段長度的單位為bp。

1.2.5 實時熒光定量 PCR體系的建立 使用QuantiFastTMSYBR green PCR kit(Qiagen，Germany)試劑盒，建立20.0μl的反應體系，其中2×Master mix 10.0μl，去離子水8.0μl，上下游引物各 0.5 μl，模板1.0μl。反應在 Rotor Gene 6000熒光定量PCR儀(Rcorbett，Australia)上進行，PCR反應條件為:95℃預變性10 min;95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環。每組試驗設置1個陰性對照。將標準質粒用ddH2O進行1∶10的稀釋，選5個稀釋梯度與樣品一起進行擴增。

1.2.6 數據分析 用SPSS16.0軟件統計分析實時熒光定量PCR數據，采用鄧肯氏新復極差法檢驗小麥不同生長期根際土壤中禾谷多黏菌數量的差異性。

2 結果與分析

2.1 禾谷多黏菌標準質粒實時熒光定量PCR檢測體系的建立

通過微量紫外分光光度計測得標準質粒的DNA濃度，計算得到禾谷多黏菌標準質粒的濃度為1μl 5.34×1010拷貝。將起始標準質粒按10倍梯度稀釋，并根據敏感度分析選取10－2～10－6倍稀釋質粒為模板進行熒光定量擴增。得到標準質粒擴增的擴增曲線和熔解曲線(圖1)。圖1顯示，標準質粒熔解曲線峰值單一，擴增曲線較光滑，呈現典型的“S”型，且間隔均勻，說明標準質粒熒光定量擴增的特異性很高。

由標準質粒擴增結果構建標準曲線(圖2)，標準曲線的相關系數(r)為0.999，擴增效率為95%，斜率為－3.444。說明該標準曲線的相關系數誤差較小，得到的數據合理有效。

根據標準質粒與土壤樣品擴增結果繪制熔解曲線(圖3)，熔解曲線的峰值為 (85.5±0.3)℃。峰值單一，沒有明顯的雜峰，且陰性對照沒有峰。說明該擴增產物特異性較高，且不受引物二聚體的影響。

綜合以上結果，可以確定該擴增體系具有較高的特異性、合理的擴增效率，擴增結果可靠。因此，該體系可用于對小麥根際土壤中禾谷多黏菌的定量檢測與分析。

圖1 實時熒光定量PCR對標準質粒的特異性檢測Fig.1 Specificity test of quantitative real-time PCR reaction to standard plasmid

圖2 實時熒光定量PCR標準曲線Fig.2 Standard curve of quantitative real-time PCR

2.2 小麥根際土壤中禾谷多黏菌數量的檢測

圖3 實時熒光定量PCR的熔解曲線Fig.3 Melting curve of quantitative real-time PCR

利用本研究建立的實時熒光定量PCR檢測體系，對轉基因小麥N12-1及其受體揚麥158根際土壤中禾谷多黏菌的數量進行檢測。檢測結果(圖4)顯示，禾谷多黏菌的拷貝數在小麥的不同生長期不同，呈現先上升后逐漸下降的趨勢。從小麥播種期的1 g土壤 5.98 ×104拷貝(N12-1)和 4.86 ×104拷貝(揚麥158)開始逐漸升高，在返青期達到最大值，分別為 1 g土壤 6.59×105拷貝(N12-1)和 8.37×105拷貝(揚麥158)，而在抽穗期、灌漿期和成熟期又逐漸下降。方差分析結果顯示，轉基因小麥N12-1與其受體揚麥158根際土壤中禾谷多黏菌的拷貝數無顯著差異(P=0.983)，但生育期之間表現出極顯著差異(P＜0.001)。

圖4 轉WYMV-Nib8基因小麥N12-1及其受體揚麥158不同生育期根際土壤中禾谷多黏菌的拷貝數Fig.4 The quantity of P.graminis in transgenic wheat N12-1 and its recipient Yangmai158 during growth

3 討論

隨著轉基因作物種植面積的不斷擴大，轉基因作物的安全性評價也不再僅僅局限于對外源基因及外源基因編碼蛋白質的直接檢測上［14］。在整個農業生產過程中，土壤微生物扮演著重要的角色。土壤微生物是土壤有機質和土壤養分轉化和循環的動力，而其群落結構和數量又受到植物根系分泌物的影響［15］。據報道，土壤中微生物的變化也能反映整個土壤環境的變化，例如土壤中真菌與細菌的比率就能反映土壤中的C∶N。因此，評價轉基因植物對土壤微生物的影響具有重要的生態學意義［16］。而在農業生產中，與土壤環境對土壤微生物群落組成的影響相比，土壤微生物數量對土壤環境的變化要更為敏感［17］。。

實時熒光定量PCR技術是一種靈敏度高、重復性好、方便快捷的定量方法［18-19］。本試驗利用實時熒光定量PCR技術，通過土壤微生物總DNA和特異性的引物對目的基因在土壤樣品中的分子數目進行絕對定量。結果表明，基于實時熒光定量PCR技術建立的檢測體系可實現對土壤中禾谷多黏菌拷貝數的實時監測。通過轉基因小麥N12-1與其受體揚麥158根際土壤中禾谷多黏菌數量的比較，發現兩個品種之間不存在顯著差異。由此推斷，轉基因小麥N12-1對其根際土壤中禾谷多黏菌的數量沒有顯著影響。而禾谷多黏菌拷貝數在小麥生育期之間的極顯著差異可能是受到小麥根系分泌物的影響。在返青期達到最大值也與小麥黃花葉病通常發病于小麥返青期相一致［20］。Wu等研究發現，轉基因小麥N12-1對其根際土壤中微生物群落結構及土壤酶活性沒有顯著影響［21］。而早在 2008 年，Liu 等［22］就通過PCR-DGGE和T-RFLP分析，證明了轉Bt基因水稻對其根系土壤中微生物群落結構沒有影響。更有學者證明轉Bt基因水稻秸稈還田后對土壤微生物功能及多樣性都沒有明顯的影響［23］。因此，本研究結果也在一定程度上有效地說明了轉基因小麥N12-1種植的安全性。

由于作物種植環境的復雜性和時效性，我們還需進行進一步的跟蹤監測，建立深入全面的檢測體系，以獲得長期有效的數據，進而闡明轉基因小麥N12-1對其根際土壤微生物生態系統的影響。

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