棉花種質種仁含油量測定及其遺傳多樣性分析

趙 君， 劉劍光， 吳巧娟， 趙 亮， 許劍文， 肖松華

(江蘇省農業科學院經濟作物研究所/農業部長江下游棉花油菜重點實驗室，江蘇 南京 210014)

棉花是中國重要的經濟作物，在國民經濟發展中具有舉足輕重的作用［1-3］。棉花不僅能夠提供重要的天然紡織原料，而且棉子中含有豐富的蛋白質、脂肪、棉子糖、維生素等，棉仁中含有30.00%以上的脂肪，其中亞油酸含量高達55.60%，為加工高級保健油的原料，對預防和治療冠心病、動脈硬化、高血壓和高血脂等心腦血管疾病具有顯著療效［4］。然而，長期以來限制棉子高效利用的根本原因在于其中含有1%～2%棉酚及其衍生物。棉酚對人和單胃動物有毒害，食用后胃粘膜組織易被破壞，引起消化功能紊亂，因此棉子這種食物資源未能被充分開發利用［5］。隨著中國內地棉花種植面積的不斷減少以及植棉經濟效益的降低，棉花育種家越來越重視特種棉花品種的選育，其中低酚棉的種仁棉酚含量低于國家食用標準(＜0.02%)和國際食用標準(＜0.04%)，具有重要利用價值，所以選育低酚棉將是提高棉花綜合利用價值的一個重要方向。

棉子含油量是受多基因控制的數量性狀，而且不同研究者所采用的材料和方法不同，獲得的研究結果也存在差別，在不同的研究中主要存在上位性、加性和顯性效應以及母體影響［6-8］。另外研究發現，棉子含油量也受環境的影響［9-10］。棉子油的主要成分是脂肪酸，而棉子中脂肪酸的代謝途徑受到多個酶的調節，其中檸檬酸合成酶和乙酰CoA羧化酶是2個最關鍵的限速酶。油酰卵磷脂基因(FAD2-1)是決定脂肪酸不同組分含量的關鍵酶。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性可以控制棉子蛋白質和油脂的比例，預測通過調節磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的表達改變棉子油分與蛋白質比例，可以提高棉子中的脂肪酸含量，創造高含油量的棉花材料［11］。

為了提高棉花的綜合利用價值，育種目標既要重視皮棉產量、纖維品質、抗病性和抗蟲性的改良，又要兼顧棉子種仁含油量的提高。本研究以高含油量和低酚棉種質系為試驗材料，對32份棉花種質系進行遺傳多樣性分析，期望為高油、低酚棉花新品種選育奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用材料包含17個低酚棉品種(系)，其中9份由中國農業科學院棉花研究所提供，分別是冀棉19、冀棉21、冀棉27、湘棉18號、遼棉11號、中棉所18、中棉所20、汾低99和海1，引入后嚴格自交繁殖保純;8份由江蘇省農業科學院選育，分別是蘇研 602、蘇研603、蘇研604、蘇研605、蘇研606、蘇研607、蘇研608和蘇研609，這些材料低酚性狀純合。12個種仁高含油量品種(系)，分別為荊55263、綿陽73-39、RNT78、紫色美棉、澳 siv-2、澳 C、澳L23、蘇聯棉91系、庫車T94-4、遠93抗354、邯鄲長絨和M11。另外3個品種為蘇棉8號、陸地棉遺傳標準系TM-1和泗抗1號，由江蘇省農業科學院經濟作物研究所保存。

1.2 SSR 分析

取各品種(系)幼嫩葉片，DNA提取方法參照Paterson等［12］的CTAB法。根據南京農業大學公布的遺傳圖譜［13］均勻選取分布于棉花26條染色體上的370對SSR引物。所有引物信息可從http://www.genome.clemson.edu/projects/cotton 網站下載。分子標記名稱中的大寫字母，如 BNL，JESPR等，代表引物的來源。Taq酶、dNTPs和PCR反應的其他試劑均購自北京天為時代公司。PCR擴增與染色參照張軍等［14］的方法。

1.3 棉花種仁含油量的測定以及脂肪酸組分分析

棉花種仁含油量測定采用國家標準GB/T 10359-1999測定方法。收取成熟期相近，成熟好的棉桃，經濃硫酸脫絨。精選200粒飽滿種子，使用工具鉗將種殼夾出裂口，除去種殼后獲得種仁，利用研缽分別對每份種仁進行充分研磨變成粉末狀。將濾紙放于105℃烘箱內烘干2.5 h，置于干燥器內冷卻至室溫，稱質量(M1)。將1 g左右棉仁粉放入濾紙包內，105℃烘箱內烘干2.5 h，置于干燥器內冷卻至室溫，稱質量 (M2)。將稱質量過后的裝有棉仁粉的紙包放入抽提管內，使用無水乙醚浸泡16 h，再使用無水乙醚抽提8 h，控制抽提速度，保證1 h內抽提6～8次。抽提后，取出紙包，靜止過夜，待殘留乙醚完全散發后，在105℃烘箱內烘干2.5 h，稱質量(M3)。棉仁含油量計算公式為:M=(M2－M3)/(M2－M1)×100%。每份樣品含油量數據均測定3次，取平均值，并保留兩位有效小數。

脂肪酸組成分析參考高建芹等［15］方法。

1.4 數據統計

對凝膠上清晰可見且有差異的條帶進行記錄，按分子量從大到小的順序計帶，有帶賦值為“1”，無帶賦值為“0”，將電泳圖譜數字化，運用統計分析軟件NTSYSpc-2.10分析數據。利用非加權類平均法(Un-weighted pair group mathematics average，UPGMA)進行聚類分析，并繪成樹狀圖。計算位點多態信息含量

2 結果與分析

2.1 種仁含油量及不同棉種脂肪酸含量分析

在本研究中，我們選擇了其中24個棉花品種(系)，測定了其種仁含油量和脂肪酸組分。結果顯示，24個品種(系)中包括常規陸地棉栽培品種(系)12個，分別是蘇研602、蘇研603、蘇研604、蘇研605、蘇研606、蘇研607、蘇研608、蘇研609、冀棉19、冀棉21、湘棉18號和泗抗1號，它們的含油量為28.26% ～32.14%，相互之間不存在顯著差異;但與其他12個高油品系相比，存在顯著差異。脂肪酸組分方差分析結果顯示，不同品種(系)之間脂肪酸組分存在顯著差異(表1)，但是在高含油量品種和低含油量品種之間沒有明顯差異，即脂肪酸不同組分的含量與含油量之間沒有顯著相關性(表2)。

表1 不同棉花品種(系)種仁含油量和脂肪酸組分Table 1 The oil content and percentage of fatty acids in different cotton varieties

根據脂肪酸組分測定結果，我們分析了不同品種間飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量。其中，飽和脂肪酸包括肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸;單不飽和脂肪酸包括棕櫚油酸、油酸和花生烯酸;多不飽和脂肪酸包括亞油酸和亞麻酸。結果顯示，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的含量與含油量之間不存在顯著相關性。飽和脂肪酸含量變幅為24.00% ～28.20%，其中含量最高的是邯鄲長絨，最低的是湘棉18號。單不飽和脂肪酸含量變幅為15.12% ～20.52%，其中含量最高的是荊55263，最低的是蘇研604。多不飽和脂肪酸含量變幅為51.93% ～59.57%，其中含量最高的是蘇研602，最低的是邯鄲長絨(表3)。

表2 含油量與脂肪酸組分間的相關系數Table 2 Correlation coefficients between oil content and percentage of fatty acid

表3 不同棉花品種(系)間飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量Table 3 The contents of saturated and unsaturated fatty acids in cotton varieties

對24個品種(系)的含油量和脂肪酸組分的遺傳多樣性分析結果顯示，在供試的24個品種(系)中，不同品種(系)的含油量和脂肪酸組分均呈正態或近似正態分布;脂肪酸組分中，肉豆蔻酸、硬脂酸和亞麻酸在不同品種(系)中分布比較集中，遺傳多樣性較差。棉花種仁含油量在不同品種之間差異很大，變 幅 為 28.26%～41.06%，變 異 系 數 為12.17%。其中含油量最高的是 M11，達到41.06%;最低的是蘇研606，含油量為28.26%。在供試的24個品種(系)中，棉花種仁脂肪酸組分在不同品種(系)之間存在非常大的差異，其中變異最大的是花生烯酸，變異系數達到20.30%;肉豆蔻酸含量變幅為0.61% ～0.92%，其中含量最高的是泗抗1號，最低的是澳 C;棕櫚酸含量變幅為20.90% ～24.67%，其中含量最高的是邯鄲長絨，最低的是湘棉18號;棕櫚油酸含量變幅為0.44%～0.59%，其中含量最高的是蘇聯棉91系，最低的是冀棉19;硬脂酸含量變幅為2.40% ～3.25%，其中含量最高的是泗抗1號，最低的是蘇研608;油酸含量變幅為14.15% ～19.66%，其中含量最高的是荊55263，最低的是蘇研 605;亞油酸含量變幅為51.66% ～59.26%，其中含量最高的是蘇研602，最低的是邯鄲長絨;亞麻酸含量變幅為 0.21%～0.40%，其中含量最高的是蘇研608，最低的是庫車T94-4;花生稀酸含量變幅為0.22% ～0.47%，其中含量最高的是湘棉18號，最低的是冀棉19(表4)。

表4 種仁含油量及脂肪酸組分的統計分析Table 4 Statistical analysis of oil content and percentage of fatty acid in 24 cotton varieties

2.2 SSR引物篩選及標記信息分析

依據南京農業大學構建的遺傳圖譜［13］，在各連鎖群每隔10 cM選取1個SSR標記位點，共選用SSR標記370對。對供試的32份材料進行多態性初篩，其中190對引物擴增穩定，并表現出多態性，多態性比率為51.35%(表5)。

其中A亞組多態性位點百分率為59.16%，D亞組為43.46%。在190個多態性位點上共檢測到609個等位變異，各位點檢測到的等位變異數不同，變幅為2～9個，平均為3.09個;只檢測到2個等位變異的位點有78個，占總多態位點的41.05%;檢測到3個等位變異的位點50個，占26.31%;檢測到4個等位變異的位點33個，占17.37%;檢測到5個等位變異的位點17個，占8.95%;檢測到6個及6個以上等位變異的位點僅12個，占6.32%。檢測到2～3個等位變異的位點數占總位點數的67.38%，說明試驗選擇的資源中等位變異數普遍較少，遺傳多樣性較低。190個位點多態信息含量(PIC)變幅為0.07～0.81，平均為0.40;多樣性指數變幅為0.15～0.83，平均為0.46;其中檢測到最多等位變異數的標記是BNL3383，位于D9染色體，檢測到的等位變異數是9個，PIC值為0.81。A、D亞組分析結果顯示，A亞組平均等位變異數為3.25，多樣性指數為0.49;D亞組平均等位變異數為3.06，多樣性指數為0.47，說明陸地棉A亞組遺傳多樣性略高于D亞組。D亞組可能攜帶更多的控制重要育種目標性狀的基因，在長期的品種改良中承受著更高的選擇壓力，從而造成更多、更強的選擇牽連效應(表6)。

表5 基因組多態性標記分布Table 5 Polymorphic marker distribution on 26 chromosomes of 32 cotton varieties

表6 190對SSR位點多態性信息統計Table 6 Information of 190 polymorphic SSR loci

2.3 遺傳多樣性和系譜分析

明確品種間親緣關系是育種中親本組配的前提。運用統計分析軟件NTSYSpc-2.10分析32份材料的遺傳多樣性。利用非加權類平均法(Un-weighted pair group mathematics average，UPGMA)進行聚類分析，并繪成樹狀圖(圖1)。32份材料被分成5個類群，在第一類群中包含本研究所有的19個陸地棉低含油量品種(系)，分別是蘇研系列品種(系)、冀棉19、冀棉21、冀棉27、遼棉11號、汾低99、泗抗1號、中棉所18、中棉所20、TM-1以及蘇棉8號。第二類群和第五類群只包含1個品種，分別是海1和紫色美棉。第三類群包含高含油量品種(系)綿陽73-39和荊55263。第四類群包含剩余的高油品種(系)，分別是 RNT78、澳 siv-2、澳 C、澳 L23、蘇聯棉91系、庫車 T94-4、遠93抗354、邯鄲長絨和 M11。由分類結果可知，本研究所涉及的32個品種(系)中的高含油量品種(系)與低含油量品種(系)的遺傳差異比較大，遺傳距離遠。高含油量品種(系)分布于3個類群，表明高含油量種質資源遺傳基礎比較豐富。

2.4 標記與棉花種仁含油量的關聯分析

為減少群體結構和個體間親緣關系對關聯分析結果的影響，本研究分別利用TASSEL 2.1軟件［17］的一般線性模型(General linear model，GLM;Q)和混合線性模型(Mixed linear model，MLM;Q+K)程序，將196個位點的等位變異分別與種仁含油量進行關聯分析。

與種仁含油量關聯的位點見表7。采用一般線性模型檢測到與種仁含油量性狀顯著關聯的位點11個，分布在9條染色體上，其中A亞組7個，D亞組4個;混合線性模型檢測到與種仁含油量性狀顯著關聯的位點9個，分布在7條染色體上，其中A亞組6個，D亞組3個，與標記NAU2325和NAU5428連鎖的位點沒有檢測到。A12和D3染色體上檢測到2個位點，A12染色體上的位點分別是標記BNL598和標記NAU3294，D3染色體上的位點分別是標記NAU2325和NAU4052。一般線性模型檢測到的位點解釋變異 0.056 0～0.144 9，其中達到極顯著水平的3個，分別是A12、D2和A2染色體上的標記BNL598、CIR246和NAU5384;采用混合線性模型檢測到的位點解釋變異 0.043 6～0.132 3，其中達到極顯著水平的位點3個，與一般線性模型檢測到的極顯著位點相同(表7)。

圖1 32份材料的聚類分析圖Fig.1 Clustering analysis of 32 cotton germplasm

表7 與棉仁含油量性狀顯著相關的標記位點及其對表型變異的解釋率Table 7 Marker loci associated with oil content trait and their explained phenotypic variations

3 討論

棉花是一種重要的經濟作物，它不僅給人類提供了纖維原料，而且種子含有18% ～20%的油脂，棉花種仁直接榨油可生產高質量的食用油，由于棉酚存在，極大地限制棉花種仁的利用。低酚棉種仁榨油無需精煉脫毒，可直接食用，所以選育顯性低酚高含油量棉花種質對今后提高棉花整體利用價值具有重要意義［4］。本研究利用32份棉子材料其中包含17個低酚棉品種(系)和12份高油材料，測定其種仁含油量及脂肪酸組分，結果顯示，通過雜交選育的低酚棉品種(系)種仁含油量顯著低于高油材料，這與前人報道的含油量的遺傳偏向低油親本一致，即通過多代雜交選育，棉花種仁含油量將會不斷降低［18］。同時也有研究結果表明，棉花的母體效應對子代含油量存在影響，其效應要高于遺傳影響，這意味著在品種選育過程中選擇高含油量材料或低含油量材料做母本，對雜交后代種仁含油量將會有顯著影響［6，19］。

利用分子標記研究不同棉花品種(系)的遺傳多樣性，分析其遺傳背景的差異，可以為今后通過配制棉花雜交組合選育高油低酚棉花種質提供參考。本研究將32份材料通過聚類發現，低含油量品種(系)和高含油量品種(系)分為2大類，而且這2類群之間親緣關系比較遠。前人的研究結果表明，種仁含油量與棉花產量之間沒有相關性，與棉酚含量呈正相關［20-21］。說明在棉花產量及相關性狀的改善和提高時不會降低棉花種仁含油量。出現現有品種(系)的含油量顯著低于高油種質的含油量的現象，主要有兩方面的原因:(一)棉花種仁含油量的遺傳模式可能會使雜交后代含油量降低;(二)棉花種仁含油量不是育種家在棉花品種選育過程中關注的主要指標，導致現有品種(系)含油量的降低。

棉花種仁含油量是數量性狀，受多基因控制。Yu等［22］利用陸地棉與海島棉回交群體共檢測到17個與油份含量相關的QTLs，分布在12條染色體上，其中位于A12染色體上檢測到2個QTLs，其中1個解釋表型變異23.64%。劉小芳等［23］以陸地棉重組自交系群體為材料共檢測到8個與含油量相關的QTLs，其中位于D7染色體上的1個QTL在2個環境中能同時檢測到。李曉娜等以89份半野生棉為材料，應用關聯分析，在3個年份環境下重復檢測出12個與棉仁含油量顯著相關的位點［24］。本研究檢測到的與含油量相關的位點與前人研究部分相同，這與研究材料不同有關系。另外本研究獲得的與已經報道的不同的與棉仁含油量性狀顯著相關的標記位點，可能為棉仁含油量性狀的分子標記輔助選擇提供依據。

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