內生真菌HL-1的除草活性及對作物的安全性

程 亮， 郭青云

(1.青海省農林科學院植物保護研究所/青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧 810016;2.農業部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，青海 西寧 810016)

農田雜草是農業生產和農產品質量的重要影響因 子之一，化學除草劑可有效去除農田雜草并在提高農作物產量方面起到不可低估的作用。但從20世紀70年代中期以來，抗藥性雜草種類不斷上升，環境污染問題日益顯現。微生物除草劑因其對目標雜草以外的植物影響小、環境負效應小、安全性高等優勢而成為近年來雜草生物防治研究中的一個較為活躍的領域。

近年在生防真菌的新菌株篩選、致病力和寄主專一性測定、擴散與流行規律、商品化產品開發等方面的研究取得了顯著進展 。強勝等通過對雜草病原代謝產物的研究，先后成功研制出2種微生物源除草劑［4］。李俊、楊葉、李永龍等先后研究了有關病原微生物代謝產物的除草活性［5-7］。強勝、王惠、李榮金等對除草活性物質開展了分離純化等研究［8-10］。Schulz等對從不同植物中分離到的6 500株內生真菌進行活性測定，發現80%～83%具有抗細菌、抗真菌和除草活性［11］。

內生真菌代謝途徑及代謝物的多樣性不僅與其種屬有關，還與其所處的微生態環境有關。青藏高原獨特的環境條件孕育了獨特的微生物群落，但青海在雜草病原菌的收集及生防研究領域的相關工作較少。我們從2010年開始從青海共分離獲得53株微生物，其中在刺兒菜葉上獲得一株具有強致病力的植物內生菌HL-1菌株。

本研究擬對菌株HL-1進行菌餅致病性和發酵濾液除草活性等研究，并對其生防安全性進行初步評估，旨在為今后深入研究、開發微生源除草劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集及病原菌的分離純化

從青海省化隆縣采集發病的刺兒菜(Cirsium setosum)葉片，將其分裝于自封袋中，實驗室內對發病癥狀進行記錄、拍照，并于4℃冰箱保存備用。參照文獻［12］對刺兒菜葉片病害標本進行分離和培養，每個PDA培養基平板上放置5個組織塊，培養4 d后病組織表面出現菌絲，接種針挑取菌絲進行病原菌的純化并編號。

1.2 HL-1菌株的致病性測定

1.2.1 菌餅的致病性測定 采集野外健康新鮮的豬殃殃(Galium aparine L.)、藜(Chenopodium album L.)、冬葵(Malva crispa L.)、酸模葉蓼(Polygonum lapathifolium L.)幼葉，用無菌水沖洗3次后自然晾干，放置于墊有無菌濾紙的培養皿(Φ=9 cm)內，在培養7 d的菌落邊緣取菌餅(Φ=8 mm)接種到葉片正面，以接種無菌的PDA培養基塊為對照，置于(25±1)℃光照培養箱中保濕培養，分別于接種后3 d、5 d觀察葉片發病情況。

1.2.2 代謝產物的致病性測定 在培養7 d后的菌落邊緣取菌絲塊接種到裝有200 ml PD的培養瓶中，每瓶接5塊，25℃、150 r/min培養14 d，培養液真空抽濾，濾液再用微孔濾膜(Φ=0.45μm)過濾獲得不含菌體的代謝產物濾液，將濾液噴霧接種于7～10葉期健康盆栽豬殃殃、藜、冬葵、酸模葉蓼植株上，接種量為每盆20 ml。接種后的雜草植株置于28℃、12 h光暗交替的人工氣候箱中用塑料袋套袋保濕培養。每處理重復4次，以只接種無菌PD培養液的植株作為空白對照。分別于處理后3 d、5 d和7 d后觀察雜草的發病情況，發病程度分級參照文獻［13］。處理7 d后計算發病率、病情指數和鮮質量防效。計算公式如下:發病率=發病葉片數/調查葉片總數×100%;病情指數=Σ(各級病葉數×各級代表值)/(調查總葉數×最高級代表值)×100;鮮質量防效=(對照雜草鮮質量－處理雜草鮮質量)/對照雜草鮮質量×100%。

1.3 HL-1菌株對作物安全性測定

將HL-1菌株發酵濾液以每盆20 ml分別噴霧接種于3～4葉期的小麥(Triticum aestivum L.)、油菜(Brassica napus L.)、蠶豆(Vicia faba L.)、豌豆(Pisum sativum L.)、青稞(Hordeum vulgare L.)上，培養方法同方法1.2.2。每處理重復4次，以只接種無菌PD培養液的植株作為空白對照。7 d后調查作物發病情況。按以下標準記載發病程度:NS表示無癥狀(無病斑，植株正常生長);LS表示輕微感病(葉片分布零星斑點，生長略受抑制);MS表示中等感病(1/5～1/4的葉面積出現病斑，生長受抑制);SS表示嚴重感病(1/4以上葉片面積出現病斑，生長受到嚴重抑制)。

1.4 HL-1菌株的鑒定

1.4.1 形態鑒定 將菌株HL-1于PDA培養基上培養，光學顯微鏡下觀察其菌絲、孢子形態。將直徑為8 mm菌絲塊接種于培養基平皿(Φ=9 cm)，25℃培養，每天定時觀察菌落生長形態，顯微鏡觀察其菌絲和孢子形態。

1.4.2 分子鑒定 菌株DNA提取參照文獻［13］。選取通用引物ITS4擴增基因組DNA的 ITS區，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。PCR擴增反應體系(50.0μl)如下:4.0μl dNTP mixture(2.5 mmol/L)，ITS4(20.0 μmol/L)和 ITS5(20.0 μmol/L)各1.0μl，6.0μl的10×Taq緩沖液，1.0μl Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μl)，2.0 μl模板 DNA，35.0μl無菌去離子水。PCR反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性1 min，51℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，共設35個循環;最后72℃延伸10 min。擴增產物在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳分離后，用溴化乙錠溶液(0.5μg/ml)染色15 min，通過Bio-Rad Gel Doc 2000成像系統顯示記錄電泳結果。收集PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果用chromas.exe軟件進行序列修正后，從NCBI Blast檢索與目標序列同源性高的DNA序列，與本序列分別進行菌株種內比對。利用MEGA 5.0軟件采用近鄰歸群法(Neighbor-joining)構建系統發育樹，各分支的置信度自舉檢測(Bootstrap)1 000次。

2 結果與分析

2.1 HL-1菌株對雜草的致病性

菌株HL-1菌餅接種到豬殃殃、藜、冬葵、酸模葉蓼3 d后，雜草葉片上可觀察到輕微病變，菌餅四周長出大量菌絲，圍繞菌餅四周形成一圈褐色斑紋，其中，冬葵葉片出現輕微發黃、失綠現象;藜葉片接種部位可見白色菌絲體，同時，菌絲穿透整個葉片，布滿葉背部，5 d后菌絲擴展至整個雜草葉片;豬殃殃、冬葵整葉枯死;酸模葉蓼、藜葉片變黑腐爛。接種無菌PDA培養基的4種對照雜草葉片完好，沒有出現病變癥狀。菌餅致病性測定結果表明，HL-1菌株對這4種雜草離體葉片均表現為強致病性。

噴施發酵濾液3 d后，在供試雜草上出現不同程度的受害癥狀，豬殃殃、藜明顯表現出萎蔫、葉片卷曲的癥狀，冬葵葉片出現黃色斑點，葉尖變黃，有零星病斑產生，酸模葉蓼部分葉片出現黃色斑點。5 d后，豬殃殃表現為莖葉發黑、枯死，藜表現為莖彎曲，葉片枯死，冬葵1/2葉片發黑，癥狀由葉到莖逐漸擴展，酸模葉蓼出現大面積病斑，約1/2植株枯死。7 d后，豬殃殃、藜發病率高達98.10%和90.20%。發酵濾液對豬殃殃、藜、冬葵的平均鮮質量防效分別達到69.31%、71.83%、65.54%，顯著高于發酵濾液對酸模葉蓼的平均鮮質量防效(P＜0.05)(表1)。病情指數(表1)表明，豬殃殃、藜對菌株發酵濾液最敏感，雜草接種病菌7 d后始終無復蘇現象，病情不斷加重，直至整盆植株枯死(圖1)。無菌PD培養液(對照)對上述4種雜草葉片沒有影響(圖1)。表明，該菌株發酵濾液對豬殃殃和藜具有較好的防除效果。

表1 菌株HL-1發酵濾液對4種雜草致病力比較(7 d)Table 1 Comparison of the pathogenicities of metabolites produced by strain HL-1 against four weeds(7 d)

1 菌株HL-1發酵濾液的致病性(7 d)ig.1 Pathogenicity of metabolite produced by strain HL-1(7 d)

2.2 HL-1菌株對作物的安全性

菌株HL-1發酵濾液對春小麥和蠶豆均無致病性，作物長勢及株高未受影響，表現為不感病(NS);春油菜表現為輕微感病(LS)，5%葉片葉緣出現黑色斑點，植株無萎蔫現象，后期病斑不擴展;青稞表現為輕微感病(LS)，少部分葉片葉脈部位有零星斑點，葉片發黃，后期病斑不擴展;豌豆表現為輕微感病(LS)，株高抑制率為5.8%(表2)。

表2 供試作物對菌株HL-1的敏感性Table 2 Sensitivities of the crops to strain HL-1

2.3 HL-1 菌株鑒定

2.3.1 形態特征 PDA平板上HL-1菌落呈同心圓生長，生長速度快，一周后滿皿。氣生菌絲發達，初期為白色，后期漸變為褐色，最后變為黑色(圖2A)。菌絲有隔，中間部位凹縮(圖2B)。分生孢子有明顯的橫縱隔，孢子平面呈橢球形，不易萌發(圖2C)。

圖2 HL-1的形態特征(×1 000)Fig.2 Morphological characteristics of strain HL-1(×1 000)

2.3.2 分子鑒定 從用近鄰歸群法構建的系統發育樹(圖3)可見，菌株HL-1的ITS與植物內生菌屬的ITS高度相似，其中與內生真菌 FJ450003.1、FJ450011.1和JN986768.1的匹配度均達到 99%。結合形態觀察，鑒定菌株HZ-1為內生真菌。

圖3 基于ITS r DNA序列的菌株HL-1的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HL-1 based on ITS r DNA sequence

3 討論

植物病原毒素是植物病原產生的次生代謝產物，在病原菌侵染寄主的過程中起著重要的作用，常常能加強病原菌的侵染危害程度。目前對具有除草活性的微生物代謝產物的報道很多，如Arshad 2011年［14］從木霉屬4個種的培養濾液中獲得的粗毒素可以明顯減少小麥田雜草小子虉草(Phalaris minor L.)和齒果酸模(Rumex dentatus L.)的根莖長度和生物量;Phattanawasin［15］發現費希爾曲霉(Aspergillus fischeri TISTR 3272)產生的代謝產物對刺軸含羞草(Mimosa pigra)和稗草(Echinochloa crus-galli)的胚根和芽長抑制率達到80%以上;王靜［16］從紫莖澤蘭內生菌中提取的粗毒素對油菜和高粱胚根、胚芽的伸長有較強的抑制作用;Dor［17］發現 Fusarium oxysporum f.sp.orthoceras的發酵濾液產生的鐮刀菌酸和9，10-dehydrofusaric acid(DFA)能引起 Helianthus annuus、Orobanche cuman、Sonchus oleraceus植株失綠和萎蔫。本研究從發病的刺兒菜葉中分離得到HL-1菌株，其發酵濾液對試驗靶標雜草幼苗具有不同程度的致死作用，對豬殃殃和藜具有很強的致病性，噴施于植株后可導致其葉片發黃枯萎甚至整株枯死。

植物內生真菌開發成為微生物除草劑，多數是利用它們的次生代謝生物，在應用時首先應該考慮的是對作物不致病。菌株HL-1從自然發病的刺兒菜葉上分離獲得，代謝產物對春小麥和蠶豆很安全，雖可使油菜和青稞幼苗感病，但只產生斑點型病害，病斑不擴散，不影響青稞、蠶豆后期生長，但對豌豆植株株高有輕微的抑制作用。可見，該菌的代謝產物對多數雜草有抑制作用的同時對作物相對安全，可以在以豬殃殃和藜為優勢雜草的春小麥和蠶豆田中安全使用。

利用微生物代謝產物開發的微生物源除草劑既有化學農藥易加工、使用方便的特點，又有生物農藥安全易降解的特性。此外，還可以對其代謝產物進行提純和結構鑒定，通過仿生合成等途徑開發新型除草劑。因此，內生真菌HL-1菌株代謝產物的應用前景很大，可進一步加強有關制劑開發及活性成分的結構鑒定。

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