Streptomyces eurocidicus JXJ 0089對銅綠微囊藻的抑制

李漢全， 張炳火， 楊建遠， 查代明， 過七根， 石 翔， 郭 靜

(九江學院藥學與生命科學學院，江西 九江 332000)

藍藻水華是世界性的水污染問題，暴發時產生大量藍藻毒素，造成嚴重的環境問題［1-4］，威脅人類健康 ，給水產養殖業帶來巨大的經濟損失 。隨著全球氣候變暖、富營養化加劇，藍藻水華發生頻率日益增加，水華水體藻毒素濃度也越來越高［8］。雖然目前有物理、化學和生物操縱等多種水華防治方法，但這些方法具有諸多缺點，如成本高、容易造成二次污染，選擇毒性差或者只能適應小面積水域［9-13］。因此，迫切需要尋找新型、高效、環保的藍藻水華防治方法。

研究結果表明，環境中存在大量的抑藻放線菌，這些放線菌可分泌許多抑藻活性成分，殺死藻細胞，諸如賴氨酸［14］、鏈霉素［15，16］、niromycin A［17］、anthracidin A［18］、萬古霉素、D-環絲氨酸、新生霉素［19］、七 尾 霉 素 A 甲 酯［20］和 2-hydroxy-12-oleanene-3，28-O-D-glucopyranosyl［21］等，其中部分化合物對水華藍藻選擇毒性好，如賴氨酸對微囊藻具有抑藻活性，但是對硅藻和綠藻卻沒有毒性［22］。因此，抑藻放線菌及其代謝產物在水華藍藻防治中具有重要的潛在應用價值。

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)是引起水華的最常見藻種［23-24］，是微囊藻毒素的主要產生者［25］，也是中國藍藻水華的主要藻種。本研究以銅綠微囊藻FACHB-905為指示藻，篩選抑藻放線菌，并初步研究其對銅綠微囊藻的抑藻活性及其部分影響因素。

1 材料與方法

1.1 指示藻

銅綠微囊藻(M.aeruginosa FACHB-905)，購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫，并利用平板劃線法進行純化，獲得無菌藻株。藻種在25℃、30～50μmol/(m2·s)、光暗比為12 h∶12 h的條件下靜置培養，每天搖動4次，每次30 s左右，藻培養基為HGZ培養基。藻平板制作參照文獻［26］進行。

HGZ液體培養基:NaNO3496.0 mg，KH2PO439.0 mg，MgSO4·7H2O 75.0 mg，CaCl2·2H2O 36.0 mg，Na2SiO3·9H2O 58.0 mg，土壤提取液 3.0 ml，金屬鹽溶液3.0 ml(Na2-EDTA 75.0 mg，FeCl3·6H2O 9.7 mg，MnCl2· 4H2O 4.1 mg，ZnCl20.5 mg，CoCl2·6H2O 0.2 mg，Na2MoO4·2H2O 0.4 mg，蒸餾水100.0 ml)，蒸餾水 994.0 ml，pH 8.0 ～8.5。

1.2 抑藻放線菌的篩選及形態鑒定和16SrRNA系統發育分析

采用點接法，將土壤中分離的放線菌接種于YIM 38固體平板培養基 ，28℃下培養4～7 d后，用無菌打孔器將長有菌落的瓊脂塊取出并置于藻平板上，按照方法1.1的條件培養，3 d后觀察抑藻圈的產生情況，并根據抑藻圈的有無判斷菌株是否產生抑藻活性物質。

參照文獻［27］對菌株的形態進行鑒定以及對16SrRNA基因序列進行系統發育分析。采用埋片法制備放線菌菌絲樣本，利用掃描電鏡觀察菌絲形態。采用溶菌酶法提取基因組DNA，用細菌通用引物primer A(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和primer B(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')進行PCR擴增，檢測序列，并將其16SrRNA基因序列在GenBank核酸序列數據庫中進行序列同源性比較，通過CLUSTALX和MEGA軟件進行序列比對分析，并以Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.3 菌株JXJ 0089液體培養時間

將生長良好的斜面菌種接入YIM 38#液體培養基，培養48 h后，按照10%(體積比)的接種量接入無菌液體培養基(組成:葡萄糖15.0 g，大豆粉15.0 g，酵母浸粉2.0 g，淀粉 10.0 g，蛋白胨 2.0 g，麥芽浸粉 2.0 g，NaCl 4.0 g，K2HPO40.4 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，Ca-CO32.0 g，H2O 1 000 ml，pH7.8)，于 180 r/min、28℃搖床培養，每24 h取樣1次，連續取樣13次，培養液在4 500 r/min的條件下離心10 min，上清液置于無菌容器中，于4℃冰箱保藏備用。取2%(體積比)的上清液加入銅綠微囊藻藻液(5×106CFU/ml)中，采用方法1.1的培養條件進行培養，3 d后采用熱乙醇法測藻液的葉綠素 a(Chl.a)含量［28］，并根據抑藻效率(%)=(1－Ct/Cc)×100%(Cc和Ct分別為對照組和試驗組Chl.a的濃度)計算抑藻效率，根據各樣品抑藻效率確定發酵時間。

1.4 上清液抑藻活性組分分析

將放線菌培養液的上清液進行真空冷凍干燥，干燥物分別用乙酸乙酯、甲醇和去離子水溶解，減壓蒸餾除去各樣品溶液的溶劑后稱質量，再將各樣品配制為2μg/μl的溶液，用移液器取20μl溶液于無菌濾紙片(直徑為0.6 cm)上，置于無菌培養皿中，待溶劑完全揮發后將濾紙片再置于藻平板上，按照方法1.1中的方法培養1～3 d后，用游標卡尺測量抑藻圈直徑，根據抑藻圈直徑判斷樣品抑藻活性強弱，并利用薄層層析(TLC)硅膠板進行分析，利用Anis顯色劑［29］和茚三酮顯色劑顯色。

1.5 菌株JXJ 0089的孢子、菌絲體和藻液之間的相互影響

1.5.1 菌株JXJ 0089孢子與銅綠微囊和藻之間的相互影響 取純化的無菌藻和未純化的有菌藻各100 ml(5×106CFU/ml)，分別加入2 ml放線菌孢子懸液(1.0×107CFU/ml)，8 d后檢測抑藻效率。并用顯微鏡觀察藻液中是否存在放線菌菌絲體，并取0.1 ml藻液涂布于YIM 38#固體平板上，28℃下培養，連續觀察7 d，記錄放線菌和細菌的生長情況。對照組試驗藻液加入2 ml無菌水。

1.5.2 菌株JXJ 0089菌絲體與銅綠微囊藻之間的相互影響 分別取 0 g、0.15 g、0.30 g、0.45 g和0.60 g菌絲體(濕質量)，加入 100 ml(5×106CFU/ml)無菌藻和有菌藻中，8 d后測抑藻效率。用顯微鏡觀察藻液中放線菌的菌絲形態，并取0.1 ml藻液涂布于YIM 38#固體平板上，于28℃下培養，連續觀察7 d，記錄放線菌和細菌生長情況。

1.6 藻液中抑制放線菌JXJ 0089的細菌

采用平板劃線法，對藻液中的細菌進行分離純化，在獲得純培養細菌后，再將其點接于涂布有放線菌JXJ 0089孢子的平板培養基上，培養3 d后觀察細菌菌落周圍是否出現抑菌圈。提取有拮抗活性的細菌的基因組，對其16S rRNA基因序列進行系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 抑藻放線菌的篩選及形態鑒定和16SrRNA系統發育分析

試驗結果顯示，對照組YIM 38#培養基在藻平板上未產生明顯抑藻圈，而用于篩選的160株放線菌中，35株能夠在藻平板上形成明顯的抑藻圈，其中放線菌JXJ 0089形成的抑藻圈較透明，這說明該菌產生的代謝產物抑藻活性較強，或者活性成分的含量較高，因此選為后續研究菌株。

放線菌JXJ 0089在固體平板上生長初期氣絲相對較少，但隨著培養時間的延長，氣絲變得極為發達，灰白色，基絲灰褐色，產生水溶性黃褐色色素，孢子絲與 S.eurocidicus［30］類似，為典型鏈狀輪生，孢子橢圓形，表面光滑(圖1)。16S rRNA基因序列(1 529 bp;GenBank登錄號:KP193140)分析結果表明，放線菌JXJ 0089屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的成員，與S.eurocidicus NRRL B-1676T親緣關系最近(99.73%)，采用鄰接法構建系統進化樹，該菌和S.eurocidicus NRRL B-1676T聚在單獨的一支上(圖2)。結合形態特征，將放線菌 JXJ 0089鑒定為Streptomyces eurocidicus JXJ 0089。

圖1 菌株JXJ 0089在YIM 38#培養基上28℃培養14 d后孢子絲的掃描電鏡照片Fig.1 Scanning electron micrograph of spore chains of S.eurocidicus JXJ 0089 after growth on YIM 38#medium at 28℃for 14 d

2.2 菌株JXJ 0089培養時間

由圖3可知，菌株JXJ 0089在28℃、180 r/min的條件下培養11 d后，其上清液抑藻效率為88.02% ±1.63%，此后變化不明顯，因此確定發酵時間為12 d。

2.3 上清液抑藻活性組分分析

抑藻活性組分分析結果顯示，乙酸乙酯溶解的組分抑藻活性較弱，抑藻圈直徑為8.92 mm，甲醇溶解的組分抑藻活性較強，抑藻圈直徑為13.65 mm，去離子水溶解的組分，抑藻活性最強，抑藻圈直徑為16.73 mm，這說明該菌產生多種抑藻活性物質。TLC檢測和顯色劑顯示結果表明，乙酸乙酯和甲醇溶解部分的代謝產物化學多樣性豐富，而水溶性成分茚三酮顯色明顯，主要為含氨基的化合物。

2.4 放線菌的孢子、菌絲體與銅綠微囊藻之間的相互影響

2.4.1 孢子與銅綠微囊藻之間的相互影響 抑藻活性分析結果顯示，放線菌JXJ 0089的孢子對無細菌藻的抑藻效率為2.17% ±4.06%，對有細菌藻的抑藻效率為6.53% ±3.88%，兩種情況下的抑藻效率沒有顯著差異(P＞0.05)，與對照組相比，其Chl.a含量也均無顯著差異(P＞0.05)。顯微鏡觀察結果顯示，在無細菌藻液和有細菌藻液中，孢子均未萌發。涂布培養結果顯示，加入放線菌孢子的無細菌藻液涂布培養1～2 d后，平板上即長出大量放線菌菌落，但加入放線菌孢子的有細菌藻液涂布培養7 d后，平板上仍然未長出放線菌菌落，這說明，無細菌藻液中的放線菌孢子的萌發雖然受到藻液抑制，但并未死亡，因此涂布在固體培養基上能夠迅速萌發生長;而在有細菌藻液中的放線菌孢子已經死亡，因此涂布在固體培養基上長時間培養后仍未見萌發生長。

圖2 菌株JXJ 0089及親緣關系最近的相關種以鄰接法構建的16S r RNA基因系統進化樹Fig.2 Phylogenotic tree of strain JXJ 0089 and other related species of Streptomyces based on 16Sr RNA gene sequences by neighbour-joining

圖3 培養時間對S.eurocidicus JXJ 0089抑藻活性的影響Fig.3 Influence of culture time on the inhibitory activity of S.eurocidicus JXJ 0089

2.4.2 菌絲體與銅綠微囊藻之間的相互影響 由圖4可知，在100 ml藻液中加入0.2 g菌絲體培養8 d后，有細菌藻和無細菌藻中Chl.a的去除率分別為 52.51% ±2.02%和66.89% ±2.34%，但隨著菌絲體的繼續增加，Chl.a的去除率沒有大幅度增加，即使菌絲體增加到0.8 g，有細菌藻和無細菌藻中Chl.a的去除率也僅分別為 59.00% ±1.98%和76.35% ±1.55%。在藻細胞初始濃度相同的情況下，菌株JXJ 0089菌絲體對無細菌藻Chl.a的去除率顯著高于有細菌藻(P＜0.01)。顯微鏡觀察顯示，無論是在有細菌藻中還是在無細菌藻中，放線菌JXJ 0089的菌絲形態沒有明顯變化。但平板涂布培養試驗結果顯示，加入放線菌菌絲的無細菌藻液涂布培養1～2 d后，即長出大量放線菌菌落，而加入放線菌菌絲的有菌藻液涂布培養7 d后，仍然未見放線菌長出，這說明，在無細菌藻液中的放線菌菌絲體未死亡，而在有細菌藻液中的放線菌菌絲體已經死亡。

圖4 放線菌JXJ 0089的菌絲體對有細菌藻和無細菌藻葉綠素a(Chl.a)的去除率Fig.4 The removal rates of Chl.a in the impure and pure culture of M.aeruginosa by the mycelia of actinomycete strain JXJ 0089

2.5 藻液中抑制放線菌的細菌

經平板劃線，從M.aeruginosa FACHB-905培養液中純化到19株細菌，抑菌試驗發現，4株細菌(編號分別為 CY-7、CY-12、CY-16和 CY-19)的菌落周圍出現明顯的抑菌圈，表明它們對放線菌JXJ 0089具有抑制作用。16SrRNA基因序列分析結果表明，細菌 CY-7與Sphingomonas koreensis JSS26T親緣關系最近，序列相似性為98.42%，在系統進化樹上它們聚在一支(圖5A);細菌 CY-12(1 420 bp)與Pseudomonas azotoformans IAM1603T親緣關系最近，為99.72%，在系統進化樹上它們聚在一支(圖5B);細菌 CY-16(1 410 bp)與 Agrococcus terreus DNG5T的親緣關系最近，為99.72%，在系統進化樹上它們聚在一支(圖5C);細菌CY-19(1 541 bp)與Modestobacter marinus 42H12-1T的親緣關系最近，為99.12%，在系統進化樹上它們聚在一支(圖5D)。這些細菌產生何種物質抑制抑藻放線菌JXJ 0089，以及這些細菌對銅綠微囊藻的生長有何影響，目前正在進一步研究中。

3 討論

抑藻放線菌廣泛存在于水陸環境中，且對水華藍藻具有抑制作用的菌株比率很高［14，31］，這與本研究結果一致。目前發現的抑制藍藻的放線菌主要為鏈霉菌，如 S.achromogenes［32］、S.phaeofaciens［14］、S. jiujiangensis［33］、S. lushanensis［34］、S. exfoliates［35］、S.endus［17］、S.neyagawaensis［18，36］和 S.hebeiensis 等，本研究首次報道鏈霉菌S.eurocidicus對藍藻有抑制活性。

S.eurocidicus代謝產物豐富，能夠產生多種抗生素，如叔霉素、氮霉素、優洛殺菌素［37］，但尚未有文獻報道這些抗生素有抑藻活性。本研究發現，S.eurocidicus JXJ 0089能夠分泌多種極性不同的活性成分，抑制銅綠微囊藻生長，其中水溶性成分主要是氨基類化合物。鏈霉菌產生的含氨基的抑藻物質有蛋白質［36］和賴氨酸［14］，另外，含有賴氨酸的多肽往往也具有抑藻活性［38］。TLC分析和茚三酮顯色結果說明，S.eurocidicus JXJ 0089產生的水溶性氨基類化合物極性比賴氨酸小，顯色也不同，因此應該是其他含氨基的化合物。

放線菌的孢子在無細菌銅綠微囊藻藻液中不能萌發生長，但并未死亡，其菌絲體在無細菌藻液中也能存活，這說明藻細胞或其產生的藻毒素等代謝產物，雖然對放線菌具有一定的抑制作用，尤其是抑制其孢子萌發，但對放線菌的孢子或菌絲體均沒有明顯的致死作用。

藍藻附生細菌對藍藻的生長有重要影響，它們的生理活動或部分代謝產物對藻細胞的生長有促進作用［39］。我們發現，在藻細胞起始濃度相同 (5×106CFU/ml)的情況下，有細菌藻生長速率顯著高于無細菌藻，8 d后葉綠素 a含量達到 (1.111±0.042)mg/L，比無細菌藻 (0.688 ±0.051)mg/L高(P＜0.01)，這可能是附生細菌通過其生理代謝活動，降低了對藻細胞有害物質的濃度，改善了藻細胞的生長環境，或者為藻細胞提供了一些生長所需要的營養成分，從而促進了藻細胞的生長，這應該是S.eurocidicus JXJ 0089菌絲體對無細菌藻的抑藻效率顯著高于有細菌藻的重要原因之一。

微囊藻附生細菌包括α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Actinobacteria和 Bacteroidetes等，其中α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria 是 其 主 要 類群［40-44］。從 M.aeruginosa FACHB-905藻液中分離的4株對S.eurocidicus JXJ 0089有抑制作用的細菌，其中CY-7屬于α-Proteobacteria的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，CY-12 屬于γ-Proteobacteria的假單胞菌屬(Pseudomonas)，而CY-16和CY-19分別屬于Actinobacteria的土壤球菌屬(Agrococcus)和貧養桿菌屬(Modestobacter)，Sphingomonas和 Pseudomonas是目前研究最多的兩類微囊藻附生細菌。微囊藻的存在有利于附生細菌的生存，增強了細菌吸附有機物等各種營養物質的能力，為細菌提供了有機碳源和更為安全的生長環境［39］。因此，附生細菌可能會抑制一些對藻細胞有害的微生物，降解其抑藻物質，保護藻細胞，以達到維護自身良好生存環境條件的目的，這可能是S.eurocidicus JXJ 0089菌絲體對無細菌藻的抑藻效率顯著高于有細菌藻的另一個重要原因。這些研究結果表明，利用抑藻微生物防治藍藻水華，必須充分考慮藻細胞的附生細菌在其中的作用。

圖5 銅綠微囊藻附生細菌及相關種以鄰接法構建的16S r RNA基因系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of attached bacteria species of M.aeruginosa based on 16S r RNA gene sequences by neighbor-joining

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