穩(wěn)定表達(dá)人TMPRSS2蛋白質(zhì)懸浮生長(zhǎng)MDCK細(xì)胞系的構(gòu)建

馮 磊， 吳培培， 褚 軒， 陳 麗， 王偉峰， 侯繼波

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014)

目前采用連續(xù)傳代細(xì)胞系，如MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞等替代SPF雞胚在生物反應(yīng)器中進(jìn)行禽流感病毒的大規(guī)模增殖制備是科研單位、獸用疫苗生產(chǎn)企業(yè)競(jìng)相開展的研究熱點(diǎn)［1-3］。禽流感病毒表面的HA蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞上病毒受體結(jié)合的先決條件是HA蛋白質(zhì)在其堿性氨基酸(Lys或Arg)位點(diǎn)進(jìn)行有效裂解，形成HA1蛋白質(zhì)和HA2蛋白質(zhì)，這二者之間由二硫鍵連接。HA1蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)識(shí)別宿主細(xì)胞膜上的糖鏈?zhǔn)荏w，HA2蛋白質(zhì)的N端有一段融合肽負(fù)責(zé)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合，在H+攻擊下由病毒的M2蛋白質(zhì)形成離子通道幫助病毒核酸向胞內(nèi)釋放，繼而進(jìn)入細(xì)胞核完成逆轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、翻譯表達(dá)等后續(xù)過程［4］。禽流感病毒能夠在SPF雞胚中增殖的一個(gè)重要原因就是雞胚尿囊液中含有大量的蛋白酶，能夠?qū)Σ《玖Ｗ颖砻娴腍A蛋白質(zhì)進(jìn)行裂解［5-6］。而禽流感病毒在體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞，如MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞中增殖一般都需要在病毒增殖過程中添加經(jīng)TPCK處理的胰蛋白酶［7-9］。這種蛋白酶弱化了胰凝乳蛋白酶的活性，增強(qiáng)了對(duì)堿性氨基酸(如Arg、lys)位點(diǎn)的裂解能力，從而能夠保證禽流感病毒HA蛋白質(zhì)的正確裂解［10-11］。但外源蛋白酶的添加對(duì)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)造成的影響是不可逆的，特別是病毒連續(xù)傳代后的蛋白酶積累對(duì)宿主細(xì)胞生理狀態(tài)影響極為嚴(yán)重，進(jìn)而影響流感病毒的增殖效率。

如果流感病毒增殖細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)蛋白酶，并定位表達(dá)于細(xì)胞膜的外側(cè)則可以省去添加外源的蛋白酶，既可完成對(duì)病毒粒子表面的HA蛋白質(zhì)裂解，又不會(huì)對(duì)細(xì)胞自身產(chǎn)生影響。人Ⅱ型跨膜型絲氨酸蛋白酶(Type II transmembrane protease serines，TMPRSS)是新近發(fā)現(xiàn)的一類特殊蛋白酶，該蛋白質(zhì)從N端往C端依次是胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Cyto.D)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)、主干區(qū)(低密度脂蛋白A類受體區(qū)LDLRA、富含半胱氨酸的清道夫受體區(qū)SRCR、原結(jié)構(gòu)域Pro)、消化結(jié)構(gòu)域(Catalytic domain)［12］，其中跨膜區(qū)結(jié)合于細(xì)胞膜上，主干區(qū)和消化結(jié)構(gòu)域則表達(dá)定位于細(xì)胞膜的外側(cè)，具有對(duì)蛋白質(zhì)消化酶解的功能［13］。TMPRSS2主要存在于前列腺中，最近也有報(bào)道稱該蛋白酶在人類呼吸道上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)［14］。如果我們?cè)诹鞲胁《驹鲋乘拗骷?xì)胞中重組表達(dá)該跨膜類蛋白酶，其本身并不釋放到培養(yǎng)液中，只是消化結(jié)構(gòu)域表達(dá)定位到細(xì)胞膜外側(cè)，對(duì)其細(xì)胞本身不存在任何蛋白質(zhì)消化作用，但可以對(duì)初始結(jié)合于細(xì)胞膜上的病毒粒子HA蛋白質(zhì)進(jìn)行有效酶解，進(jìn)而提高病毒感染效率，增加病毒的增殖滴度。

本試驗(yàn)試圖構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)人TMPRSS2蛋白質(zhì)的重組MDCK細(xì)胞系，并且能夠在生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)對(duì)該重組細(xì)胞株的單細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)，為禽流感病毒在動(dòng)物細(xì)胞上更好地適應(yīng)傳代以及大規(guī)模制備禽流感疫苗的技術(shù)革新提供一條有效的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、禽流感病毒、載體、抗體等生物材料單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的MDCK-Sus細(xì)胞由國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心對(duì)ATCC引進(jìn)的貼壁生長(zhǎng)MDCK細(xì)胞自行馴化適應(yīng)并建系保藏。禽流感H9亞型病毒:A/chicken/Jiangsu/02/09(JS02)、A/chicken/Jiangsu/03/11(JS03)、A/chicken/JiaXing/02/11(JX02)、A/chicken/XiGang/04/01(XG04)、A/chicken/HangZhou/03/01 (HZ03)、A/chicken/HeNan/03/01(HN03)由國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心分離鑒定并保藏，真核細(xì)胞表達(dá)載體pIRES由國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心保藏，兔抗人TMPRSS2蛋白質(zhì)的一抗購(gòu)自Santa Cruz生物技術(shù)公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)公司。

1.1.2 主要生物試劑 Trizol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、pMD19-T載體、oligo dT、各種限制性內(nèi)切酶、Ex Taq酶、T4 DNA連接酶等分子生物學(xué)材料均購(gòu)自TaKaRa公司。質(zhì)粒大提試劑盒、核酸膠回收試劑盒等購(gòu)自 Qiagen公司。DMEM、G418、Opti-MEM、PEI(25 000線性)試劑等購(gòu)自Invitrogen公司。TPCK處理的胰蛋白酶、細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)基組分(大豆蛋白水解物、酵母提取物、轉(zhuǎn)鐵蛋白、激素、F-68等成分)購(gòu)自Sigma公司。細(xì)胞膜蛋白質(zhì)抽提試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pIRES-TMPRSS2表達(dá)載體的構(gòu)建 采用NheⅠ/XbaⅠ雙酶切含有人TMPRSS2蛋白質(zhì)ORF的質(zhì)粒載體以及pIRES質(zhì)粒，將TMPRSS2目的片段及pIRES質(zhì)粒的骨架片段進(jìn)行電泳后回收，定量后進(jìn)行核酸片段連接，轉(zhuǎn)化至DH5α中，挑選連接陽性菌落并大量擴(kuò)增，質(zhì)粒抽提后酶切驗(yàn)證重組真核表達(dá)載體pIRES-TMPRSS2。經(jīng)質(zhì)粒大提后獲得轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒。

1.2.2 G418作用濃度的篩選 MDCK-Sus細(xì)胞接種于50 ml TPP培養(yǎng)管(瑞士TPP公司，87050)中，其中培養(yǎng)體積為10 m1，初始細(xì)胞密度為1 ml 5×105個(gè)。在不同的培養(yǎng)管中加入不同濃度的G148，濃度 為 100 μg/ml、200 μg/ml、300 μg/ml、400 μg/ml、500 μg/ml、600 μg/ml、700 μg/ml、800 μg/ml，置于37 ℃、5%CO2，轉(zhuǎn)速為 100 ～250 r/min培養(yǎng)搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每日取樣觀察并測(cè)定細(xì)胞存活率，培養(yǎng)6～12 d，記錄細(xì)胞死亡情況，確定G418的最小有效工作濃度。

1.2.3 陽離子聚合物介導(dǎo)的懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染 接種初始細(xì)胞密度為1 ml 5×105個(gè)的MDCK-Sus細(xì)胞株于50 ml TPP培養(yǎng)管中，懸浮培養(yǎng)過夜后用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將懸浮培養(yǎng)用培養(yǎng)基更換為Opti-MEM培養(yǎng)基孵育10 min。以10 ml細(xì)胞懸液為1個(gè)轉(zhuǎn)染單位，采用PEI試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行MDCK-Sus細(xì)胞的懸浮轉(zhuǎn)染操作，具體轉(zhuǎn)染步驟見文獻(xiàn)［15］。轉(zhuǎn)染8 h后，以1 000 r/min離心3 min，將含有剩余轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)上清液去除，更換成MDCK-Sus細(xì)胞株的正常懸浮培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩懸浮培養(yǎng)。

1.2.4 MDCK-Sus-TMPRSS2 細(xì)胞克隆的篩選 轉(zhuǎn)染后18～24 h的MDCK-Sus細(xì)胞株經(jīng)離心回收按照1∶12的比例重新分散至15 ml新鮮懸浮培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37 ℃、5%CO2，轉(zhuǎn)速為 100 ～200 r/min，懸浮培養(yǎng)液中G418的工作濃度為300μg/ml，細(xì)胞初始密度大致為1 ml 1×105～3×105個(gè)。按照每5 d換1次液的頻率進(jìn)行G418持續(xù)篩選，第一輪篩選時(shí)間大致為3～4周。選擇能夠在有G418篩選壓力下持續(xù)增殖的重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞克隆繼續(xù)懸浮培養(yǎng)傳代。該傳代操作以離心去除培養(yǎng)上清液并重懸細(xì)胞沉淀來實(shí)現(xiàn)。第二輪篩選中將G418篩選工作濃度提高至600μg/ml繼續(xù)加壓篩選。最終獲得能夠在G418抗性篩選中穩(wěn)定持續(xù)懸浮生長(zhǎng)的重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞株。

1.2.5 RT-PCR、Western blot、間接免疫熒光鑒定將篩選出來的MDCK-Sus-TMPRSS2重組細(xì)胞株經(jīng)離心收集，PBS清洗3遍后按Trizol法從細(xì)胞中抽提總RNA，具體方法參照Trizol試劑說明書。以oligo dT為逆轉(zhuǎn)錄引物按常規(guī)方法逆轉(zhuǎn)錄生成總cDNA后，以其為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為p1:5'-GGATGGCTTTGAACTCAGGGTCACC-3'，p2:5'-GGCATTAACCCTCACTAAAGGGAAG-3'，擴(kuò) 增 程序如下:95℃ 3 min;98℃ 30 s，60℃ 35 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

將篩選出來的MDCK-Sus-TMPRSS2重組細(xì)胞株經(jīng)離心收集、PBS清洗3遍后用于膜蛋白質(zhì)抽提。以5%濃縮膠和8%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳，采用半干式轉(zhuǎn)膜操作將膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)BSA封閉后，采用人TMPRSS2蛋白質(zhì)的兔源一抗及HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育有目的蛋白質(zhì)的PVDF膜，采用DAB顯色劑顯色鑒定目的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

將篩選出來的MDCK-Sus-TMPRSS2重組細(xì)胞株經(jīng)離心收集分為兩份，一份在96孔板中用于細(xì)胞靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞展開生長(zhǎng)后固定并進(jìn)行免疫熒光檢測(cè);另一份樣品采用75%冷丙酮直接固定于96孔板中進(jìn)行免疫熒光測(cè)定。以人TMPRSS2蛋白質(zhì)的兔源一抗以及FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)PBS清洗3遍后在熒光顯微鏡下觀察重組人TMPRSS2蛋白質(zhì)在MDCK-Sus細(xì)胞上的表達(dá)情況。上述鑒定試驗(yàn)均以母本MDCK-Sus細(xì)胞為空白對(duì)照，按照相同操作步驟進(jìn)行鑒定。

1.2.6 重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及生長(zhǎng)曲線測(cè)定 重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞以1 ml 3×105個(gè)的初始密度接種于250 ml的培養(yǎng)搖瓶中，放置于37℃、5%CO2，轉(zhuǎn)速為120 r/min的培養(yǎng)搖床中進(jìn)行種子細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，以母本MDCK-Sus細(xì)胞為對(duì)照。在3 L生物反應(yīng)器(荷蘭Applikon公司產(chǎn)品)中，重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞以1 ml 3×105～5×105個(gè)的初始密度接種于1 600 ml初始培養(yǎng)體積中，設(shè)置培養(yǎng)轉(zhuǎn)速60～180 r/min，培養(yǎng)溫度37℃，溶解氧(DO)為50%，pH值為7.1，進(jìn)行初始批式培養(yǎng)，培養(yǎng)96 h后進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，每24 h取樣測(cè)定細(xì)胞密度，計(jì)算細(xì)胞比生長(zhǎng)速率。

1.2.7 禽流感 H9亞型病毒在 MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞上的適應(yīng)傳代 在50 ml TPP細(xì)胞培養(yǎng)管中，以重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞、母本MDCK-Sus細(xì)胞為增殖細(xì)胞連續(xù)傳代6株禽流感H9亞型病毒，每種病毒連續(xù)傳15代，分別在第1、第5、第10、第15代測(cè)定增殖病毒的HA效價(jià)和半數(shù)組織培養(yǎng)物感染滴度，判斷兩種增殖宿主細(xì)胞對(duì)禽流感病毒的連續(xù)傳代能力。僅母本MDCK-Sus細(xì)胞在連續(xù)傳代增殖6株禽流感H9亞型病毒時(shí)添加2μg/ml的TPCK處理的胰蛋白酶。

1.2.8 AIV-H9亞型病毒HA效價(jià)及TCID50滴度的檢測(cè) 采新鮮公雞血，經(jīng)抗凝處理及PBS清洗后制成0.5%雞血球PBS液。在HA檢測(cè)96孔板上以PBS連續(xù)對(duì)倍稀釋病毒檢測(cè)樣品至第11孔，第12孔以PBS作為對(duì)照。每孔分別加入25μl 0.5%雞血球PBS液，在振板器上振動(dòng)10 s，室溫下作用30～40 min。依據(jù)血球凝集程度判定反應(yīng)結(jié)果，以出現(xiàn)完全凝集的最大稀釋度為該病毒樣品的血球凝集效價(jià)(HA titer)。

含有10%血清正常培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞在96孔板中長(zhǎng)至單層時(shí)接入連續(xù)10倍稀釋的禽流感病毒樣品，每個(gè)稀釋度接入8孔，每孔200μl病毒稀釋液，病毒稀釋液中含有0.5%的血清和5μg/ml的TPCK處理的胰蛋白酶。3 d后檢測(cè)每孔培養(yǎng)上清液的HA效價(jià)，有HA效價(jià)即判定該孔為陽性，紀(jì)錄每個(gè)稀釋度的陽性孔數(shù)，按照Reed-Muench方法計(jì)算病毒滴度，以1 ml lg TCID50來表示。

2 結(jié)果

2.1 pIRES-TMPRSS2載體的酶切驗(yàn)證

利用2個(gè)酶切位點(diǎn)將目的片段連入真核表達(dá)載體中，獲得pIRES-TMPRSS2真核表達(dá)載體用于后續(xù)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。NheⅠ/XbaⅠ雙酶切pIRES-TMPRSS2載體鑒定結(jié)果顯示，目的片段大小為1 492 bp，質(zhì)粒載體骨架片段大致5 500 bp，大小正確，如圖1所示。經(jīng)質(zhì)粒大提獲得質(zhì)量較高的質(zhì)粒，OD260/OD280的值為1.81，用于后續(xù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

圖1 重組pIRES-TMPRSS2載體的NheⅠ/XbaⅠ雙酶切電泳鑒定Fig.1 Double enzymatic digestion of recombinant plasmidp IRES-TMPRSS2 with NheⅠ/XbaⅠ

2.2 MDCK-Sus-TMPRSS2重組細(xì)胞的克隆、篩選及鑒定

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在300μg/ml G418篩選環(huán)境中經(jīng)過28 d的篩選，獲得了能夠正常持續(xù)懸浮生長(zhǎng)的重組細(xì)胞株。將存活的細(xì)胞株分散至含有600μg/ml的G418篩選TPP培養(yǎng)管中繼續(xù)加壓篩選，最終獲得能夠持續(xù)生長(zhǎng)的MDCK-Sus-TMPRSS2重組細(xì)胞。

經(jīng)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞株可擴(kuò)增出1 500 bp左右的特異條帶，與目的條帶大小一致，而母本MDCK-Sus細(xì)胞的擴(kuò)增結(jié)果為陰性，如圖2所示。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組MDCK細(xì)胞株表達(dá)了分子量為53 000的目的蛋白質(zhì)，而母本MDCK-Sus細(xì)胞無目的蛋白質(zhì)表達(dá)，如圖3所示。經(jīng)間接免疫熒光檢測(cè)，懸浮生長(zhǎng)的重組細(xì)胞株可以表達(dá)人TMPRSS2蛋白質(zhì)，如圖4A所示。同時(shí)靜置培養(yǎng)該細(xì)胞，使其貼壁生長(zhǎng)后，再用間接免疫熒光也可檢測(cè)出人TMPRSS2蛋白質(zhì)的特異性表達(dá)(圖4B)，而對(duì)照母本細(xì)胞未見特異性熒光，如圖4C所示。

圖2 TMPRSS2蛋白質(zhì)的RT-PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of TMPRSS2 by RT-PCR

圖3 MDCK細(xì)胞中TMPRSS2蛋白質(zhì)的Western blot檢測(cè)Fig.3 Detection of TMPRSS2 in MDCK cells by Western blot

2.3 MDCK-Sus-TMPRSS2重組細(xì)胞的懸浮生長(zhǎng)性能

重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞的懸浮生長(zhǎng)曲線如圖5所示。與母本MDCK-Sus細(xì)胞比較，重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞的生長(zhǎng)速率基本無變化，在250 ml搖瓶中培養(yǎng)細(xì)胞獲得最大的細(xì)胞密度為1 ml 2.7 ×106個(gè)，平均比生長(zhǎng)速率為 0.438 d－1，基本與母本細(xì)胞沒有差異(母本細(xì)胞最大細(xì)胞密度1 ml 2.65×10個(gè)，平均比生長(zhǎng)速率為0.453 d )，說明經(jīng)過外源基因轉(zhuǎn)染及篩選操作后獲得的重組細(xì)胞生長(zhǎng)性能基本沒有發(fā)生變化。

圖4 TMPRSS2蛋白質(zhì)的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)Fig.4 Identification of TMPRSS2 expression by IFA

圖5 MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞與母本MDCK-Sus細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)曲線Fig.5 Suspension growth curves of MDCK-Sus-TMPRSS2 cells and parental MDCK-Sus cells

為了驗(yàn)證該重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞是否具備大規(guī)模懸浮生長(zhǎng)的能力，在3 L生物反應(yīng)器中對(duì)該重組細(xì)胞進(jìn)行了分批(0～96 h)和補(bǔ)料式(96～168 h)聯(lián)合培養(yǎng)，培養(yǎng)周期可以達(dá)到144～168 h，在培養(yǎng)后期經(jīng)補(bǔ)料培養(yǎng)后的最大細(xì)胞密度可達(dá)到1 ml 6.83×106個(gè)(圖 6)，同時(shí)細(xì)胞存活率始終保持在92%以上，說明該重組細(xì)胞株有望在種子細(xì)胞培養(yǎng)階段和病毒培養(yǎng)階段均可以保持較好的懸浮生長(zhǎng)性能，有利于禽流感病毒在生物反應(yīng)器中的大量增殖。

2.4 不同AIV-H9亞型病毒在重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞上的連續(xù)傳代培養(yǎng)

圖6 MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞在3 L反應(yīng)器中懸浮生長(zhǎng)曲線Fig.6 Suspension growth curve of MDCK-Sus-TMPRSS2 cells cultured in 3-L bioreactor

結(jié)果如表1所示，在不使用TPCK處理的胰蛋白酶條件下，重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞可以正常增殖6株禽流感H9亞型病毒，且利用該重組細(xì)胞進(jìn)行禽流感病毒連續(xù)傳代時(shí)可以逐步提高病毒的增殖效率，在連續(xù)盲傳10代后，子代病毒的血凝效價(jià)仍保持較高的水平。母本MDCK-Sus細(xì)胞在2μg/ml TPCK處理的胰蛋白酶條件下連續(xù)增殖該6株禽流感病毒5代，增殖效率與重組細(xì)胞株的增殖效率差異不大，但連續(xù)增殖10代后，其子代病毒的血凝效價(jià)逐步降低，無法獲得理想的增殖效果。重組MDCK-Sus-TMPRSS2和母本MDCK-Sus細(xì)胞在連續(xù)盲傳15代JS03株禽流感病毒接毒后，母本MDCK-Sus細(xì)胞在接毒24 h后就呈現(xiàn)出細(xì)胞邊緣毛糙皺縮現(xiàn)象，病毒增殖后期呈現(xiàn)出細(xì)胞裂解不完全的現(xiàn)象，病毒增殖效率不佳。MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞在接毒后24 h，細(xì)胞邊緣清晰;病毒增殖后期細(xì)胞感染充分，裂解完全(圖7)。

表1 不同AIV-H9亞型病毒在2種MDCK細(xì)胞上的連續(xù)傳代培養(yǎng)Table 1 AIV-H9 virus adaptation in MDCK-Sus-TMPRSS2 cells and MDCK-Sus cells to several passages

圖7 JS03株在重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞和母本MDCKSus細(xì)胞連續(xù)盲傳禽流感病毒JS03株15代后的細(xì)胞形態(tài)Fig.7 The morphologies of MDCK-Sus-TMPRSS2 and MDCK-Sus cells after AIV-JS03 strain adaptation to 15 passages

在6株禽流感H9亞型毒株的連續(xù)傳代15代后，檢測(cè)其病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)物感染滴度，結(jié)果(圖8)顯示，通過重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞增殖的6株病毒均可獲得較高的病毒滴度，均高于1 ml 4.5lg TCID50，說明病毒經(jīng)重組 MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞連續(xù)盲傳后子代病毒粒子具有較好的感染性。由母本MDCK-Sus細(xì)胞連續(xù)盲傳的子代病毒滴度均低于1 ml 3.5lg TCID50，說明經(jīng)母本MDCK-Sus細(xì)胞連續(xù)盲傳的子代病毒的感染能力明顯下降。

圖8 禽流感病毒在重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞和母本MDCK-Sus細(xì)胞中連續(xù)盲傳15代后的滴度Fig.8 AIV titers adapted in MDCK-Sus-TMPRSS2 and MDCK-Sus cells to 15 passages

3 討論

2010年 Bottcher-Friebertshauser報(bào)道，在重組MDCK細(xì)胞中經(jīng)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá)的TMPRSS2蛋白酶可裂解細(xì)胞內(nèi)新合成的流感病毒HA蛋白質(zhì)，同時(shí)也可以裂解被吞入胞內(nèi)尚未被蛋白酶裂解的流感病毒HA蛋白質(zhì)，提高了流感病毒增殖滴度［16］。在人肺變型病毒(HMPV)的增殖宿主Vero細(xì)胞中重組表達(dá)TMPRSS2蛋白質(zhì)可有效切割該病毒F蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)該病毒的高效增殖［17］。在冠狀病毒(SARS-CoV)的增殖試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在受體細(xì)胞表面成功表達(dá)TMPRSS2蛋白質(zhì)將有效酶解SARS病毒的S蛋白質(zhì)，大大增加因該病毒感染而造成的合胞體的形成比例［18］。在PEDV的增殖過程中也發(fā)現(xiàn)，宿主細(xì)胞重組表達(dá)TMPRSS2蛋白質(zhì)同樣增強(qiáng)了對(duì)病毒Spike蛋白質(zhì)的裂解能力，進(jìn)而增強(qiáng)了病毒感染宿主細(xì)胞及子代病毒粒子向胞外釋放的比例［19］。在我們的試驗(yàn)中，利用PEI這種陽離子聚合物介導(dǎo)將人TMPRSS2蛋白質(zhì)表達(dá)載體懸浮轉(zhuǎn)染至母本MDCK-Sus細(xì)胞中，從而獲得了重組MDCK-Sus-TMPRSS2細(xì)胞。該重組細(xì)胞可以在不添加TPCK處理的胰蛋白酶條件下連續(xù)盲傳適應(yīng)6株H9亞型禽流感病毒，有效增殖獲得子代禽流感病毒。且在盲傳代次較高的情況下，仍然可以正常完成病毒的增殖過程，病毒增殖適應(yīng)良好，表現(xiàn)出較高的HA效價(jià)和半數(shù)組織感染滴度。而在對(duì)照母本MDCK-Sus細(xì)胞中，病毒的增殖適應(yīng)隨盲傳代次提高而逐漸下降，這可能是由TPCK處理的胰蛋白酶積累，從而影響宿主細(xì)胞生理狀態(tài)，也可能與子代病毒粒子中非完整病毒粒子或非感染性病毒粒子的比例上升有關(guān)，具體機(jī)理仍然有待研究。

此外本試驗(yàn)中獲得的重組細(xì)胞株既能夠穩(wěn)定表達(dá)TMPRSS2蛋白質(zhì)，同時(shí)也具有與母本細(xì)胞一致的單細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)能力，在生物反應(yīng)器中獲得較高的細(xì)胞培養(yǎng)密度，為日后大規(guī)模懸浮培養(yǎng)禽流感疫苗提供了一株良好的備選宿主細(xì)胞。

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