氟對幼齡茶樹葉綠素含量及抗氧化酶活性的影響

李春雷， 倪德江

(1.濰坊科技學院，山東 壽光 262700;2.華中農業大學園藝林學學院/園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北 武漢430070)

茶樹是一種富氟的植物，每千克成熟葉片中氟含量可達到上千毫克［1-2］，但生產中茶樹未見明顯的氟中毒癥狀，并且氟也不被認為是茶樹生長的必需元素。茶葉中過高含量的氟不僅危害人體健康，引起氟骨癥、氟斑牙［3］等病，也會影響茶樹本身的生理生化指標。近年來多項研究結果表明，茶樹體內過量的氟不僅會降低茶葉的滋味及香氣等品質［4-6］，而且會影響葉綠素合成及光合作用，破壞細胞膜及葉綠體等細胞結構［7］，影響多種酶的活性［8-9］。近幾年已有一些學者從茶樹抗氧化系統方面來研究茶樹耐氟的原因，但大多研究不同氟濃度對茶樹抗氧化性的影響，鮮有氟處理下茶樹抗氧化系統的動態響應方面的研究，本研究以福鼎大白茶為試驗材料，采用水培法，研究氟處理下茶樹抗氧化系統的動態變化及茶樹富集氟的特性，為深入研究茶樹中氟的毒害及解毒機理提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗幼齡茶樹為福鼎大白1年生扦插苗，由湖北省農業科學院果茶研究所提供。

1.2 試驗設計

試驗在華中農業大學實驗基地溫室中進行。選擇生長健壯、長勢較一致的茶苗，栽植前洗凈茶苗根部，采用營養液培養，其配方為1/2 Hoagland+Arnon［10］。在茶苗處理期間每天用1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉調整營養液pH為5.5±0.1，每3 h通氣1 h，每5 d換1次營養液。緩苗10 d后，以F=0 mg/L為對照，設置F=16 mg/L(NH4F)進行處理，處理6 h，12 h，24 h，48 h，72 h 后分別收集第3 片、第4片茶苗鮮葉，經液氮快速冷凍后于－80℃超低溫冰箱貯存備用。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 酶液提取 稱取0.500 0 g去除主脈的鮮葉置于預冷的研缽，加入0.500 0 g石英砂和10 ml預冷的pH為7.8、含有0.1 mmol/L EDTA、5%PVP的50.0 mmol/L磷酸緩沖液，置于冰浴上研磨至勻漿，勻漿液于16 000 r/min(4℃)離心15 min，上清液用于測定 SOD、CAT、POD 活性［11］。

1.3.2 測定方法 葉綠素、類胡蘿卜素含量測定參考Jiang［12］的方法。超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化氫(H2O2)含量均采用試劑盒(南京建成生物工程有限公司生產)測定。過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創木酚法［7］。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法 測定。

1.4 數據分析

采用 Excel 2003進行數據計算和作圖，采用SAS分析軟件進行LSD顯著性檢驗及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 茶樹葉片中的氟含量

由圖1可知，隨著處理時間的延長，對照茶樹葉片中的氟含量變化趨勢平穩，加氟處理下隨著處理時間的延長茶樹葉片中的氟含量顯著升高，在6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 分別比 0 h 升高 3.89%、8.55%、6.41%、11.39%、14.68%。加氟處理茶樹葉片中的氟含量比對照顯著升高，在 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 分別比對照增加 3.09%、10.17%、8.67% 、14.27% 、13.76% 。

圖1 氟處理下茶樹葉片中氟含量變化Fig.1 Changes of fluoride content in tea leaves with fluoride treatment

2.2 氟對茶樹葉片中葉綠素、類胡蘿卜素含量的影響

加氟處理和對照的茶樹葉片中葉綠素a的含量隨著處理時間的延長均呈波浪形變化，在12 h和24 h時，加氟處理與對照差異顯著，其他處理時間，加氟處理與對照差異均不顯著(圖2A);葉綠素b在加氟處理6 h時顯著低于加氟處理0 h，比加氟處理0 h時含量降低16.90%，之后隨著時間的延長，葉綠素b含量變化趨于平緩，但顯著低于對照，加氟處理6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 時分別比對照降低19.14%、7.01%、22.46%、16.23%、12.66%(圖2B)。這說明在短時間內氟對葉綠素b的影響大于對葉綠素a的影響?？側~綠素含量的變化趨勢與葉綠素b的變化趨勢相似，在12 h時，加氟處理的總葉綠素含量略高于對照，其他時間均顯著低于對照(圖2C)。葉綠素a/b在加氟處理6 h時顯著高于加氟處理0 h，比加氟處理0 h時含量高16.48%，之后隨著時間的延長，a/b變化趨于平緩，但均顯著高于對照，加氟處理 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 時分別比對 照 增 大 了 13.88%、11.56%、12.24%、14.43%、14.52%(圖2D)。氟對類胡蘿卜素含量的影響不顯著(P＜0.05)，與對照相比，只是在加氟處理12 h時顯著高于對照，其他時間均與對照差異不顯著(圖2E)。

圖2 氟處理下茶樹葉片中葉綠素及類胡蘿卜素含量變化Fig.2 Changes of chlorophyll and carotenoid contents in tea leaves with fluoride treament

2.3 氟對茶樹抗氧化酶的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是存在于植物細胞中最重要的清除自由基的酶類之一，它的主要功能是清除O2·－的過多積累，緩解逆境對植物體的傷害［14］。由圖3A可知，對照茶樹葉片中SOD活性隨著時間的延長呈波浪形變化，但差異不顯著;加氟處理的茶樹葉片中SOD活性隨著時間的延長顯著降低，在加氟處理 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 分別比加氟處理 0 h下 降 6.19%、10.44%、12.78%、16.52%、24.48%。加氟處理茶樹葉片中SOD活性比對照顯著下降，在加氟處理6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 茶樹葉片中 SOD 活性分別比對照 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 下降 6.8%、14.0%、12.6%、21.2%、22.8%。

圖3B和圖3C表明，對照茶樹葉片中POD、CAT活性基本沒有變化，加氟處理的茶樹葉片中POD、CAT活性隨著時間的延長均先升高后降低，兩者活性均在48 h達到最大值。其中加氟處理48 h茶樹葉片中POD活性分別比加氟處理0 h及對照48 h高31.47%和46.51%，加氟處理72 h時POD活性下降，但仍顯著高于加氟處理0 h的POD活性及對照72 h時POD活性，分別高出18.3%和33.68%;加氟處理48 h茶樹葉片中CAT活性分別比加氟處理0 h及對照48 h時CAT活性增大36.79%和30.17%，加氟處理72 h時CAT活性下降，但仍顯著高于加氟處理0 h及對照72 h的CAT活性，分別高出29.43%和32.35%。

2.4 氟對茶樹葉片MDA、H2O2含量的影響

MDA是膜脂過氧化產物，其含量的多少反映細胞膜脂過氧化程度強弱。由圖4可以看出，隨著時間的延長，加氟處理和對照茶樹葉片中的MDA含量均呈升高趨勢。在12 h時，加氟處理的MDA含量顯著高于對照的MDA含量，其他時間加氟處理茶樹葉片中的MDA含量與對照差異均不顯著。說明在短時間內加氟處理的膜質過氧化反應程度較弱，未對茶樹造成傷害。在加氟處理下，H2O2含量先升后降。在加氟處理6 h和12 h H2O2含量顯著高于對照，加氟處理24 h和72 h H2O2含量與對照無顯著差異，這也說明膜質過氧化反應較輕。

圖3 氟處理下茶樹葉片中SOD、POD、CAT活性的變化Fig.3 Changes of SOD，POD and CAT activities in tea leaves with fluoride treament

圖4 氟處理下茶樹葉片中MDA、H 2 O2含量的變化Fig.4 Changes of MDA and H 2 O2 contents in tea leaves with fluoride treament

3 討論

植物抗氧化系統中保護性酶包括SOD、POD、CAT，在長期的進化過程中，這些保護性酶之間相互協調能及時清除植物體內過多的活性氧，從而使植物免受活性氧的傷害。SOD是植物防御外界傷害的第一道防線，主要功能是將歧化為O2和，POD和CAT將毒害能力更強的H2O2氧化為無害的H2O。我們前期的研究結果表明，不同濃度的氟對細胞結構(葉綠體、線粒體、細胞膜等)及抗氧化系統產生了較大影響，在低濃度氟處理下，抗氧化系統能夠通過保護性酶的相互協調清除過量的活性氧，從而使細胞結構免受其傷害，在高濃度氟處理下，活性氧的產生速率超出了保護性酶的清除能力，致使活性氧積累，從而造成了細胞結構的破壞，這些都說明了抗氧化系統中的保護性酶對氟的積極響應［7］。在本研究中，隨著處理時間的延長，SOD活性與對照相比顯著降低，說明SOD活性對氟非常敏感。在不同濃度氟處理茶樹的試驗中，SOD活性也顯示了對氟的敏感性，我們前期的研究結果顯示隨著氟濃度的增加SOD活性顯著降低［7］，李品武等［17］的研究結果也表明隨著氟濃度的增加名山131的SOD和CAT活性均逐漸降低，杜海榮等［18］用氟處理玉米發現SOD活性也隨著氟濃度的升高而呈下降趨勢。因為SOD是一種金屬酶，含有Cu，Zn，Fe，Mn等金屬元素，氟很可能會與這些金屬元素絡合而使SOD失活，這可能是氟處理下茶樹SOD活性降低的原因之一。SOD活性的降低將導致O2·－清除減慢，但O2·－還能自動歧化為H2O2和水，CAT、POD將協調清除H2O2，將其催化為水。本研究中，CAT和POD均顯示了積極作用，隨著處理時間的延長兩者活性均顯著升高，且均比對照顯著增加，顯示了清除 H2O2的能力，唐茜等［19］、李品武等［17］以及我們前期的試驗結果［7］顯示，隨著氟濃度的增加，CAT活性和POD活性均先升高后降低。

加氟處理下，葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量均比對照降低，說明氟影響了葉綠素的合成，本研究的結果顯示氟對葉綠素b的影響要大于葉綠素a，而對類胡蘿卜素影響不顯著。

MDA含量是衡量膜質過氧化反應程度的重要指標。本研究中MDA含量與對照差異不顯著，說明氟引起的膜質過氧化反應程度較輕。因此，在短時間(0～72 h)的氟脅迫下，茶樹完全能夠依靠體內抗氧化系統的保護性酶清除掉多余的活性氧，從而保護茶樹不受傷害。

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