分散液相微萃取-高效液相色譜法測定水體中毒死蜱殘留

賀 江， 龍海波

(湖南文理學院生命科學學院，環洞庭湖水產健康養殖與加工湖南省重點實驗室，湖南省水產高效健康生產協同創新中心，湖南 常德415000)

隨著經濟和社會的發展，中國水產品的消費量逐年上升，與此同時，水產養殖業在中國環洞庭湖等地區已成為農民增收的重要途徑。然而，水體中農藥殘留等化學污染物的積累嚴重制約了中國水產養殖業的健康發展，建立水體中此類化學污染物的監測技術，成為水產品安全生產體系中的核心環節之一。毒死蜱是目前中國農業生產中廣泛應用的一種有機磷殺蟲劑，它的使用使水體中積累毒死蜱農藥殘留的風險增大。中國現行的各級農藥殘留檢測標準方法多是基于色譜或色譜-質譜聯用技術，標準方法中的樣品前處理技術仍以液液萃取技術為主，其存在操作繁瑣耗時、有機溶劑使用量大、難以實現自動化等不足。

針對傳統樣品前處理技術的各種不足，建立省時高效、有機溶劑耗用量少的樣品前處理新技術一直是分析化學領域、食品安全檢測領域的一個熱門研究方向［1］。近年來國內外學者發展建立起了多種新型樣品前處理技術，例如固相萃取(Solid-phase extraction，SPE)技術［2-3］、超臨界流體萃取(Supercritical fluid extraction，SFE)技術［4-5］、固相微萃取(Solid-phase micro extraction，SPME)技術［6-7］、懸滴微萃取(Single drop micro extraction，SDME)技術［8-9］、基于中空纖維的液相微萃取(Hollow fiber-liquid phase micro extraction，HF-LPME)技術［10］、分散液相微萃取(Dispersive liquid-liquid micro extraction，DLLME)技術［11-14］等。其中DLLME技術自建立以來，受到了國內外諸多學者的重視，該技術集采樣、萃取和濃縮于一體，避免了固相微萃取中可能存在交叉污染的問題，是一種操作簡單、快速、成本低、富集效率高且對環境友好的樣品前處理新技術，在對液體樣品進行處理時DLLME技術的優勢尤為顯著。

本研究擬建立水體中毒死蜱的DLLME—HPLC分析檢測技術，重點對DLLME技術中萃取劑與分散劑種類的選擇、萃取劑與分散劑用量的確定、樣品鹽濃度及pH等條件進行優化，使水體中毒死蜱殘留檢測技術得到改進，也可為水體中其他類型化學污染物的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

毒死蜱標準品(來自中國食品藥品檢定研究院)，四氯化碳、三氯乙烷、二氯甲烷、四氯乙烯、三氯甲烷(分析純，上海化學試劑有限公司生產)，乙腈、丙酮、乙醇、甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司生產)。

1.2 儀器與設備

P680高效液相色譜儀(美國戴安公司生產)，配可變波長紫外檢測器和自動進樣器;Diamonsil ODS色譜柱(250.0 mm×4.6 mm，5μm ODS C18，迪馬科技有限公司生產);UV-1750型紫外可見分光光度計(日本島津制作所生產);TG16-II型高速離心機;渦旋振蕩器;15 ml尖底具塞離心管;帶支架的色譜自動進樣瓶內插管。

1.3 方法與步驟

1.3.1 毒死蜱HPLC檢測條件的設定 采用UV-1750型紫外可見分光光度計對毒死蜱標準溶液進行波長掃描，確定其最佳檢測波長為300 nm。參照文獻［15］，確定毒死蜱液相色譜分析條件如下:流動相為甲醇和水(9∶1，體積比)，流速為 1.0 ml/min，柱溫25℃，進樣量15μl。在該條件下，毒死蜱色譜峰與溶劑峰分離效果較佳，且峰形較好，其保留時間約為8.3 min(圖1)。

圖1 濃度為1.0μg/ml的毒死蜱液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of 1.0 μg/ml chlorpyrifos

1.3.2 水體中毒死蜱DLLME技術關鍵參數的優化 用池塘水配制濃度為0.10 mg/L的毒死蜱模擬水樣，用于毒死蜱DLLME條件的優化。具體過程如下:將一定體積的萃取劑和分散劑分別加入到15 ml尖底具塞離心管中，輕輕搖勻，然后加入10 ml毒死蜱模擬水樣，輕輕振蕩，萃取劑均勻地分散在水相中，形成水、分散劑和萃取劑的乳濁液體系，室溫放置2 min。然后以3 000 r/min離心2 min，萃取劑沉積在離心管底部，吸取沉積相到帶支架的色譜自動進樣瓶內，按方法1.3.1所述條件進行HPLC分析。試驗設置不同種類和不同用量的萃取劑和分散劑，以及不同鹽濃度和pH的水體樣品進行對比試驗，以毒死蜱色譜峰面積為指標對上述條件進行優化。

1.3.3 水體中毒死蜱DLLME-HPLC分析技術的評價 用池塘水配制系列濃度的毒死蜱模擬水樣，按優化的DLLME條件和方法1.3.1所述HPLC條件進行分析，建立基質標準曲線用于毒死蜱的定量分析，并以信噪比(S/N)為3所對應的水樣毒死蜱濃度為檢出限。用池塘水配制濃度為0.01 mg/L、0.10 mg/L、1.00 mg/L的水體模擬樣品，按相同方法進行分析，以模擬樣品分析的回收率評價方法的準確度，以回收率的變異系數評價方法的精密度。

2 結果與分析

2.1 水體中毒死蜱DLLME技術關鍵參數的優化

圖2 萃取劑種類(a)及萃取劑(三氯甲烷)用量(b)對毒死蜱分散液相微萃取效果的影響(n=3)Fig.2 Effect of extraction agent variety(a)and volume(b)on DLLME of chlorpyrifos(n=3)

2.1.1 萃取劑類型及其用量的優化 根據DLLME技術原理，選擇萃取劑的主要原則如下:密度必須大于水且不溶于水;對目標待測物的溶解能力大;還要有較好的色譜行為，不影響目標物的定性和定量分析［11-14］。以1 000μl甲醇作為分散劑，分別考察了四氯化碳(密度1.59 g/ml)、三氯乙烷(密度1.35 g/ml)、二氯甲烷(密度1.33 g/ml)、四氯乙烯(密度1.63 g/ml)、三氯甲烷(密度1.48 g/ml)5種萃取劑(用量均為100μl)對毒死蜱的萃取效果。結果表明，除二氯甲烷外，其他4種萃取劑都能使毒死蜱得到富集，其中三氯甲烷效果最佳(圖2a)。在此基礎上，進一步對三氯甲烷的最佳用量進行了探討。結果表明，在分散劑體積一定時，隨著萃取劑體積的增大，毒死蜱的色譜峰面積呈先增大后減小的趨勢，用量為100μl時對毒死蜱的富集效果最佳(圖2b)。

2.1.2 分散劑類型及其用量的優化 根據DLLME技術原理，分散劑應能完全溶解萃取劑，且易溶于水，分散劑作用是使萃取劑和水樣溶液的接觸面積最大，其在水中的溶解度越大，形成的液滴會越小，與目標物接觸面積越大，萃取效率也越高［11-14］。以100μl三氯甲烷作為萃取劑，分別考察了乙腈、丙酮、乙醇和甲醇4種分散劑(用量均為1 000μl)對毒死蜱萃取效果的影響。結果表明，丙酮本身在300 nm處有較強吸收，不宜選用，其他3種分散劑中甲醇效果最佳(圖3a)。分散劑的體積大小將影響萃取劑在水中的分散程度，從而影響沉積體積的大小，進而影響萃取效率。因此，本研究進一步對甲醇的最佳用量進行了探討。結果表明，毒死蜱色譜峰面積隨著分散劑體積的增加而增加，這是由于隨甲醇體積增大，三氯甲烷在水中分散更充分，萃取效率也相對越高;甲醇用量為1 200μl時萃取效果達到最佳，進一步增大用量則沉積體積下降，影響進樣要求，萃取效率也降低(圖3b)。

2.1.3 水體樣品NaCl濃度與pH的優化 樣品的NaCl濃度和pH能夠影響DLLME富集效果［14］。本研究以1 200μl甲醇為分散劑，100μl三氯甲烷為萃取劑，進一步考察水樣NaCl濃度和pH對毒死蜱萃取效果的影響。結果表明，當在水體樣品中添加0.2% ～20.0%的NaCl時，DLLME過程受到較大影響，難以獲取到足量的沉積相用于后續HPLC分析，因此后續試驗中不添加NaCl。當水體pH在5～10時，毒死蜱的富集效果變化較大;在6～8時富集效果較為穩定;pH為7時毒死蜱的富集效果最佳(圖4)。

圖3 分散劑種類(a)及分散劑(甲醇)用量(b)對毒死蜱分散液相微萃取效果的影響(n=3)Fig.3 Effect of dispersing agent variety(a)and volume(b)on DLLME of chlorpyrifos(n=3)

圖4 水體樣品p H對毒死蜱分散液相微萃取效果的影響(n=3)Fig.4 Effect of pH on DLLME of chlorpyrifos(n=3)

2.2 水體中毒死蜱DLLME-HPLC分析技術的評價

評價所建立的DLLME-HPLC分析技術對毒死蜱檢測的有效性，進一步對該方法的靈敏度、準確度和精密度進行了研究。用池塘水配制系列濃度的毒死蜱模擬水樣，按優化的DLLME條件和1.3.1所述HPLC條件進行分析，得到毒死蜱定量分析的基質標準曲線為 y=113.503 0x+0.516 5，R2=0.999 9(其中y為毒死蜱色譜峰面積，x為水樣中毒死蜱濃度)。逐步稀釋模擬水體樣品，按同樣方法進行分析，當模擬水樣毒死蜱濃度為0.005 mg/L時，其峰面積約為基線噪聲的3倍，故確定該方法的最低檢出限為0.005 mg/L。對毒死蜱濃度為0.01 mg/L，0.10 mg/L，1.00 mg/L的水體模擬樣品進行5次重復分析，得其回收率和變異系數(表1)，添加樣品與空白水樣的色譜圖對比如圖5所示。由表1可知，毒死蜱添加濃度為 0.01～1.00 mg/L時，添加回收率高于85%，變異系數低于7.5%，說明所建立的方法具有較好的準確度和精密度。

圖5 空白水樣(a)與毒死蜱添加樣品(0.1 mg/L)(b)的色譜圖對比Fig.5 The chromatogram of blank water sample(a)and spiked water sample(b)

3 討論

分散液相微萃取集采樣、萃取和濃縮于一體，是一種新型的樣品前處理技術，與傳統的萃取方法相比具有操作簡單、快速、準確、成本低、對環境友好且回收率高和富集倍數高等特點，其在痕量分析領域中展現出愈來愈廣闊的應用前景。本研究建立了水體中毒死蜱DLLME-HPLC分析檢測方法，其關鍵參數為:以100μl三氯甲烷為萃取劑，1 200μl甲醇為分散劑，樣品無需添加NaCl，樣品酸堿度控制在中性為宜。該方法的最低檢測限為0.005 mg/L，其準確度和精密度均能滿足實際應用的要求。

表1 水體中毒死蜱DLLME-HPLC分析法的添加回收率及變異系數(n=5)Table 1 Spiked recovery and its coefficient of variation of chlorpyrifos in water by DLLME-HPLC(n=5)

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