蒼術酮對體外培養肝癌細胞HepG2的抑制作用

郭楠楠

(深圳大學生命科學學院，廣東深圳518000)

肝癌即肝臟惡性腫瘤，其中的原發性肝癌是我國高發的、危害極大的惡性腫瘤，由于病毒性肝炎和環境等因素的影響，肝癌有逐年上升的趨勢，且肝癌病人的相對生存率極低，所以對于治療肝癌的新藥物的需要就顯得尤為迫切。

蒼術酮是傳統中藥白術的有效成分之一，屬于倍半萜類化合物，目前關于蒼術酮的藥理作用報道不多，已有的研究表明蒼術酮具有降血糖、抗衰老、抗炎、保護肝損傷等作用，而目前國內外關于蒼術酮對肝癌細胞增殖的抑制及其凋亡發生機制的研究不多，為此筆者通過檢測蒼術酮對肝癌細胞活性的影響、細胞形態的變化及對細胞周期和凋亡的影響來探討其凋亡機制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗儀器。CO2恒溫培養箱、倒置顯微鏡、酶標儀、流式細胞儀、熒光顯微鏡。

1．1．2 試驗試劑。蒼術酮由深圳大學化工學院提供;CCK－8、細胞周期與凋亡試劑盒均由碧云天生物研究所提供;HepG2購自上海生物研究所。

1．1．3 細胞培養。試驗所用細胞需放置于含有5%CO2的37℃細胞培養箱中培養傳代，用含10%胎牛血清及雙抗(青霉素/鏈霉素)的DMEM高糖培養基進行培養;用0．25%胰酶－EDTA消化傳代，放于5%CO2的37℃細胞培養箱中繼續培養。

1．2 方法

1．2．1 CCK－8檢測蒼術酮對細胞增殖的抑制作用。取對數期生長細胞，胰酶消化吹散成單細胞狀態，調整細胞到合適濃度接種于96孔板，每孔100μl，培養24 h后去培養液，每孔加10、25、50、85、100 μg/ml的蒼術酮溶液處理，同時設立調零組和對照組，每組6個復孔。繼續培養24、36、48 h后，每孔10μl的CCK－8溶液，繼續孵育4 h后，在酶標儀上測各孔450 nm吸光度值，按以下公式計算細胞活力:細胞活力(%)=［(處理組 －空白組)/(對照組 －空白組)］×100%。

1．2．2 相差顯微鏡觀察蒼術酮誘導細胞形態的變化。取對數期生長的細胞，胰酶消化離心后吹散成單細胞狀態，以適當細胞濃度接種于24孔板，每孔1 ml，培養24 h后，換25、75、100μg/ml藥物組處理，設對照組，24 h后放置相差顯微鏡下進行觀察。

1．2．3 蒼術酮誘導HepG2細胞的細胞核的變化。取對數生長期細胞，調整到適當細胞濃度接種于六孔板，培養24 h后，換不同濃度含藥培養基，同時設對照組繼續培養24 h后，去除培養液，加入固定液0．5 ml，固定10 min。去除固定液，PBS洗滌細胞2遍，每次3 min，盡量吸盡PBS。加入0．5 ml Hoechst33258染色液，染色5 min。去除染色液，PBS洗滌2遍，每次3 min，吸盡PBS，滴加一滴抗熒光淬滅封片液，即可在熒光顯微鏡下觀察。

1．2．4 AnnexinV/PI雙染法檢測細胞的凋亡。取對數期生長細胞，消化后吹散成單細胞狀態，以適當的細胞濃度接種于六孔板每孔2 ml。培養24 h后，換25和50μg/ml藥物組處理，設對照組繼續培養24 h后收集細胞待用。PBS重懸離心細胞2次，棄上清，加入195μl AnnexinV－FITC結合液重懸細胞，加入5μl AnnexinV－FITC輕輕混勻，加入5μl碘化丙啶染色液混勻，室溫避光孵育20 min，即可上機通過流式細胞儀進行檢測。

1．2．5 細胞周期的檢測。取對數生長期細胞消化后吹散成單細胞狀態，以適當的細胞濃度接種于六孔板每孔2 ml。培養24 h后換25和85μg/ml藥物組處理，設對照組繼續培養24 h后收集細胞待用。預冷PBS洗滌離心細胞2次，加入1ml預冷70%乙醇混勻，4℃固定4 h。離心沉淀細胞，PBS洗滌離心一次，每管加入0．5 ml碘化丙啶染色液，37℃水浴30 min，隨即可用流式細胞儀上機檢測。

1．2．6 數據分析。每項試驗至少重復3次，結果是以平均值±標準差的方式表示，方差分析采用t－test，P＜0．05時有統計學意義。

2 結果與分析

2．1 蒼術酮對Hep G2細胞生長的抑制作用 由圖1可知，蒼術酮對HepG2細胞的生長有抑制作用。不同濃度的蒼術酮處理細胞24、36、48 h后，隨著蒼術酮濃度的升高，對HepG2細胞的增殖抑制作用也增加，表現為細胞活力的降低;在10～100μg/ml濃度范圍內的細胞活力與該組對照相比均有顯著差異(P＜0．01)。

2．2 相差顯微鏡觀察蒼術酮處理后Hep G2細胞形態的變化 通過相差顯微鏡觀察可以看出蒼術酮能抑制肝癌細胞的生長(圖2)。沒經藥物處理的細胞呈不規則多邊形貼壁生長，細胞緊密相接，細胞邊緣輪廓清晰，生長狀態飽滿，有的甚至堆積生長;而經藥物蒼術酮處理的細胞變得扁平，脫壁，細胞間接觸不緊密，細胞邊緣輪廓不完整，碎片狀物質增多，胞漿中類似顆粒物的物質增多。

2．3 熒光顯微鏡觀察蒼術酮作用后HepG2細胞的細胞核變化 由圖3可見，未經蒼術酮作用的細胞經Hochest33258染色后細胞核呈圓形或橢圓形，分布均勻，無深染的明亮點，熒光顯微鏡觀察下呈現均勻的弱藍色熒光;而經蒼術酮處理的細胞，隨著藥物劑量的加大，細胞形態發生了明顯的改變，有許多明亮點出現，這可能是凋亡早期細胞核染色質凝集所致，有些還具有細小的碎片，可能與細胞核裂解有關。

2．4 蒼術酮對Hep G2細胞凋亡的影響 分別用蒼術酮濃度為0、25、50μg/ml培養液處理細胞24 h后，細胞早期凋亡與晚期凋亡顯示(圖4)，在蒼術酮濃度較低時，晚期凋亡的細胞比例較低，隨著藥物濃度的增加，晚期凋亡的細胞比例增加，但小于早期凋亡細胞的比例，暗示著蒼術酮在較高濃度時可能更傾向于促進細胞早期凋亡。

2．5 蒼術酮對Hep G2細胞周期的影響 細胞周期是指由 細胞分裂結束到下一次細胞分裂結束所經歷的過程，所需時間分為4個階段。其測定原理就是根據細胞不同時期(G1、S、G2、M)中DNA的含量不同進行的，通過檢測不同時期與DNA結合的熒光染料的熒光強度來反映DNA含量。結果顯示(圖5)，與正常組相比，25和85μg/ml蒼術酮處理細胞24 h后，隨著蒼術酮作用濃度的升高，G1期所占細胞的數量減少(圖中左邊數第1個峰)，G2期所占細胞的數量逐漸增多(圖中左邊數第2 個峰)，0、25、85 μg/ml濃度對應下的 G2期細胞百分比分別是12．8%、16．9%、28．2%。由此表明蒼術酮抑制HepG2細胞增殖是通過將細胞阻滯在G2/M期。

3 結論與討論

蒼術酮是中藥材白術的有效成分之一，而作為傳統中藥的白術素來有“南術北參”的美譽，其祛風散寒、健脾益氣、明目的功效早在我國古典藥典中就有記載。隨著近年來對白術藥理學的研究，人們發現白術還有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤及免疫調節等作用，只是長期以來，白術只是作為其他中藥的配方來服用，大大限制了它自身的利用。如果把白術中的成分提純，將無疑大大提高它的利用價值。目前針對白術的有效成分之一蒼術酮的研究報道就很少，董大京等研究表明蒼術酮對高血壓有獨特的療效［1］，Hwang等研究表明蒼術酮對肝損傷的保護也起到一定的作用［2］。蒼術酮屬于倍半萜類化合物，具有的多種生物學活性也有待開發。細胞凋亡是細胞在受到外界環境因素及病理性信號刺激后發生的由基因控制的一系列細胞主動有序的死亡過程［3］。大量試驗表明，目前對于一些類似傳統中藥黃芪、紫杉醇等［4－6］均可以通過誘導細胞凋亡而發揮各自獨特的抗腫瘤作用，而有關蒼術酮對腫瘤細胞抑制影響作用的報道不是很多。

該試驗中，主要探討了蒼術酮對HepG2細胞的生長抑制作用，細胞的增值活性是反映細胞增值能力與生理功能的重要指標，當細胞因外界刺激受到損傷時，首先表現的就是其增值活性的降低。CCK－8法是目前測定細胞增值與細胞毒性的常用方法之一，CCK－8屬于MTT的升級產品，且重復性好，其測定原理為WST－8在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞的毒性成反比。顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。該試驗結果表明，隨著蒼術酮劑量濃度的增大和作用細胞時間的延長，細胞增值受到抑制，細胞活力降低。采用不同濃度蒼術酮作用HepG2細胞后，在相差顯微鏡下對細胞形態進行觀察發現，對照組細胞貼壁生長，細胞緊密相接，生長旺盛，藥物作用后細胞變得扁平，細胞間接觸不緊密，胞漿中類似顆粒物的物質增多，且伴隨有碎片物質的產生;Hoechst33258染色后在熒光顯微鏡下進行觀察發現，對照組的細胞核染色后成均勻弱藍色熒光，經藥物處理的細胞由于部分染色質會出現濃縮狀態，所以染色的細胞核會出現許多明亮點。此外，該試驗用流式細胞儀對細胞周期的測定表明蒼術酮能通過將細胞阻滯在G2/M期來抑制細胞的增殖。

總之，該試驗研究表明蒼術酮對HepG2細胞的生長有明顯抑制作用，并誘導凋亡的發生，其作用強度隨藥物濃度成正相關，有明顯的劑量依賴性，這對今后深入研究蒼術酮對肝癌細胞的凋亡機制奠定一定的理論基礎，也為進一步深入研究蒼術酮作為治療肝癌的新藥和臨床應用提供初步的試驗依據。

［1］董大京，劉蘭祥，張建．蒼術酮對高血壓的療效［J］．河北醫學，1997，3(4):63 －64．

［2］HWANG JM，TSENG TH，HSIEH Y S，et al．Inhibitory effect of atractylon on tert－butyl hydroperoxide induced DNA damage and hepatic toxicity in rat hepatocytes［J］．Arch Toxicol，1996，70:640 －644．

［3］VAN ENGELAND M，NIELAND L J，RAMAEKERS F C，et al．Annexin V－affinity assay:a review on an apoptosis detection syetem based on phosphatidylserine exposure［J］．Cytometry，1998，31:1 －9．

［4］KUMMALUET．Molecular mechanism of herbs in human lung cancer cells［J］．JMed Assoc Thai，2005，88:1725 －1734．

［5］劉偉，畢富勇．中藥誘導肝癌細胞凋亡的實驗研究進展［J］．安徽醫學，2009(10):1250 －1253．

［6］鄭煒望，華海清．中藥誘導肝癌細胞凋亡的研究進展［J］．世界華人消化雜志，2009(28):2915 －2918．