化學發光微粒子免疫法在測定他克莫司血藥濃度中的作用

汪 濤

(陜西省安康市中醫醫院檢驗科 725000)

?

·論 著·

化學發光微粒子免疫法在測定他克莫司血藥濃度中的作用

汪 濤

(陜西省安康市中醫醫院檢驗科 725000)

目的 評價分析化學發光微粒子免疫法(CMIA)在測定他克莫司血藥濃度檢測中的作用。方法 回顧性分析西安交通大學第一附屬醫院收集的60例肝腎移植患者血液標本，并將收集的血液標本均實施CMIA測定他克莫司血藥濃度，同時采用Architect i2000自動免疫分析系統對他克莫司定值質控品連續測定5 d，計算他克莫司定值質控品斜率、非線性度、截距、漂移度和攜帶污染率。結果 連續測定5 d各水平質控品測定值和靶值的偏差在允許范圍內，總不精密度(CV)也在可以接受的范圍內；同時連續測定5 d他克莫司質控品截距平均值為12.17，非線性度平均值為0.65，斜率平均值為7.62，漂移度平均值為0.15，攜帶污染率為-0.12%，斜率和截距差異均有統計學意義(P<0.05)，攜帶污染率、非線性度及漂移度和用刻度因子(中值-低值)進行校正后斜率差異無統計學意義(P>0.05)。335份血液標本濃度在3～20 μg/L的治療濃度范圍內有281份，占83.89%。結論 CMIA在他克莫司免疫抑制劑血藥濃度測定中具有良好的精密度和準確度，同時性能指標也符合臨床基本要求，可以作為他克莫司免疫抑制劑血藥濃度檢測首選方法。

血藥濃度監測；化學發光微粒子免疫法；他克莫司；精密度

他克莫司是臨床應用較為廣泛的大環內酯類抗菌藥物，目前被廣泛應用在接受器官移植的患者。他克莫司血藥濃度監測不僅能夠為臨床醫生制訂和調整用藥方案提供重要依據，同時對保證臨床藥物應用的安全性和有效性也具有重要的作用和價值[1]。目前國內外血藥濃度測定的方法主要有高效毛細管電泳法、高效液相質譜聯用法、放射免疫法和酶聯免疫吸附試驗、化學發光微粒子免疫法(CMIA)、微粒子酶免疫法[2]。其中CMIA是測定免疫抑制劑血藥濃度的一種高靈敏度的監測新方法。本研究為了分析CMIA在測定他克莫司血藥濃度中的效果，特對60例來自2012年10月到2014年10月西安交通大學第一附屬醫院接受肝腎移植患者血液標本進行分析，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年10月到2014年10月來西安交通大學第一附屬醫院接受腎移植或肝移植患者的臨床資料，共60例，其中男34例、女26例，年齡15～70歲、平均(42.63±5.74)歲，平均體質量(64.75±2.34)kg。本組所有患者均實施他克莫司藥物治療，他克莫司每隔12 h服藥一次，肝移植患者劑量為0.1～0.2 mg/kg,腎移植患者劑量為0.15～0.30 mg/kg,分2次口服。血樣標本采集時間為患者服藥前30 min，每例患者分別取3 mL上肢靜脈血液，并放置在EDTA-K2抗凝管中，患者所有血標標本均在當日進行檢測，共檢測335份血液標本。

1.2 儀器與試劑 CIMA主要采用美國雅培公司生產的Architect i2000自動免疫分析系統及其相應的標準品和配套的Tacrolimus試劑盒；質控品為美國BIO-RAD公司提供的定值質控品，他克莫司定值質控品的低值為4.90 ng/mL，中值為12.10 ng/mL，高值為20.70 ng/mL。漩渦混合器主要采用德國IKA公司生產的Votex Genius3型號。

1.3 檢測方法

1.3.1 標本處理 CMIA測定血標標本時，常規開機后，24 h運轉，并給予常規保養，將試劑放置在儀器試劑倉中，配套標準品在定標后每次測試需要進行室內質控。然后將所有的質控品、標準品及臨床樣品均按照以下測定方式進行分析：首先在1.5 mL離心管中加入200 μL樣品，然后再加入200 μL前處理液，并采用漩渦混合器進行充分漩渦，再在13 000 r/min高速臺式離心機(美國Heraeus公司生產)下離心6 min。離心結束后將上清液順序倒入樣品杯中上機測試，30 min后自動打印測試結果。另外應保證所有質控品全部在控。他克莫司藥物最低檢測限值小于或等于15.0 ng/mL，線性范圍為2.0～30.0 ng/mL。

1.3.2 定值質控品的處理 采用1.3.1標本處理方法每天按照中、中、高、低、中、中、低、低、高、高、中的順序對定值質控品測定各1次，其中前2個中值檢測結果不納入研究，而后幾項檢測中，若有1個不合格時應對該批所有數據進行重新測定，連續5 d記錄有效數據，同時保證所有質控品全部在控。

1.3.3 兩種質控品檢測結果評定方式 采用Architect i2000自動免疫分析系統對他克莫司質控品進行檢測評價：(1)測定值和靶值偏倚分析時，計算每天各水平質控品測定值均值和各級質控品測定值總均值和靶值的差值，同時根據差值不超過±15%×靶值的標準進行判斷差值是否在可以接受的范圍內。(2)總不精密度(CV)的接受范圍，總CV接受范圍主要根據文獻提供的計算方法進行計算，同時采用試劑盒說明書提供的CV允許范圍(CV<8%)為標準進行判斷總CV接受范圍。(3)質控品測定結果多元回歸分析，采用多元回歸分析法對質控品測定值進行分析，同時計算其斜率、非線性度、截距、漂移度和攜帶污染率。

2 結 果

2.1 他克莫司質控品測定值與靶值偏差分析 見表1。采用Architect i2000自動免疫分析系統對他克莫司質控品連續5 d中、高低各水平質控品測定值均值和靶值的結果分析得知，連續測定5 d各水平質控品測定值和靶值偏差在允許范圍內。

2.2 總CV分析結果 見表2。由他克莫司各級質控品測定結果可以得出總CV，分析結果可以得知，連續測定5 d各水平質控品測定值和靶值的總CV在可以接受的范圍內。

2.3 CMIA檢測60例患者臨床血液標本結果分析 本研究采用CMIA檢測60例患者335份血液標本分析得知，335份血液標本濃度在3～20 μg/L的治療濃度范圍內有281份，占83.89%，見表3。

2.4 移植后不同時間測定結果分析 見表4。將他克莫司全血濃度測定按照移植后時間進行分組比較標本頻率和血藥濃度平均值可以得知，移植后不同患者他克莫司全血濃度實測值相差較大，說明存在較大的個體差異。

表1 他克莫司各級質控品測定結果分析(ng/mL)

注：D=Y-C；允許偏差范圍為±15%×靶值。

表2 他克莫司質控品連續5 d檢測各水平質控品CV結果

注：t=S-R/3,當T<0.00時，計為0.00；U=R+T；V=U1/2;CV=V/總均值×100%。

表3 335份血液標本全血濃度測定范圍

表4 不同時間他克莫司全血濃度測定結果分析

2.5 多元回歸分析 通過對本研究連續測定5 d他克莫司各級水平質控品分析，并通過對他克莫司質控品斜率、非線性度、截距、漂移度和攜帶污染率分析得知，連續測定5 d他克莫司質控品截距的平均值為12.17，非線性度平均值為0.65，斜率平均值為7.62，漂移度平均值為0.15，攜帶污染率為-0.12%。其中斜率和截距差異均有統計學意義(P<0.05)，攜帶污染率、非線性度及漂移度和用刻度因子(中值-低值)進行校正后斜率差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

他克莫司是目前臨床常用的大環內酯類免疫抑制劑，此種藥物首次用于臨床是在1989年，其主要是從駐波鏈霉菌中發酵、純化分離出來的一種新型的免疫抑制劑。國外有關學者研究表明，他克莫司的免疫抑制作用主要是通過對T細胞釋放白細胞介素-2和白細胞介素-3、干擾素而達到抑制作用，其不僅能夠有效提高移植后腎存活率，同時對降低不良反應也具有重要作用[3]。目前此種藥物已經被廣泛應用在預防移植患者急性或者慢性排斥反應中，但是由于他克莫司藥物個體吸收率和清除率差別較大，同時具有治療范圍狹窄及口服吸收生物利用度低，用藥劑量與血藥濃度缺乏緊密的相關性，從而增加臨床給藥的難度[4-5]。因此，在使用他克莫司對肝腎移植患者治療中，應注意對患者的血藥濃度進行測定，及時根據患者的特點進行調整藥物，最大限度減少藥物對患者腎臟的損壞，抑制不良反應發生。

目前臨床常用的監測血藥濃度的方法有微粒子酶免疫法、高效液相色譜法及化學發光法等，不同的檢測方法由于檢測原理不同，對標本提取的方法及對代謝物識別方法不同等，所以檢測結果也有所不同。近年來，臨床最常用的檢測他克莫司免疫抑制劑的方法為微粒子酶免疫分析法(MEIA)。但是隨著CMIA的推出，CMIA逐漸將MEIA代替。CMIA是近年來發展起來的一種新型的高靈敏度檢測技術，其技術原理主要為：首先采用吖啶酯進行標記他克莫司分子作為酶競爭物，然后采用他克莫司單克隆抗體包被的順次微珠作為捕獲物。在對檢測血液樣品進行測定時，首先對樣品進行前處理，再將處理完后的樣品和包被單抗的順次微珠相互混合，加入吖啶酯標記的他克莫司作為酶競爭物，并與微珠上的他克莫司藥物抗體進行結合，接種采用磁場促使微珠分離，清洗后再將預激法和激發試劑產生化學發光反應，最后根據標準曲線得出他克莫司的濃度[6]。美國雅培公司生產的試劑盒就是根據此原理進行設計的。另外，多數學者研究表明，美國雅培公司生產的CMIA他克莫司測定試劑盒在Architect i2000自動免疫分析系統中應用，不僅自動化程度高，同時其準確性和精密度也非常高，目前此種技術已經得到廣泛應用，但是由于此系統價格和維修費用較高，所以基層醫院使用較少[7]。另外還有研究表明，Architect i2000自動免疫分析系統中配套使用的他克莫司檢測試劑盒的包被載體為此類顆粒，其不僅能夠有效增加反應表面積，提高檢測的靈敏度，縮短檢測時間，同時在檢測中通過采用磁力吸附法進行分離磁顆粒能夠進一步提高檢測的特異性[8]。

本研究結果表明，連續測定5 d各水平質控品測定值和靶值的偏差以及總CV均在允許接受的范圍內，同時連續測定5 d他克莫司質控品截距平均值為12.17，非線性度平均值為0.65，斜率平均值為7.62，漂移度平均值為0.15，攜帶污染率為-0.12%，斜率和截距差異有統計學意義(P<0.05)，說明定值質控品測定值和參考值具有恒定誤差；攜帶污染率、非線性度、漂移度和用刻度因子(中值-低值)進行校正后斜率差異無統計學意義(P>0.05)，說明CMIA具有非常好的線性關系。關于肝腎移植后他克莫司的理想治療范圍一般推薦為移植后初期12 h全血濃度在5～20 ng/mL。本研究結果顯示，335份血液標本濃度在3～20 μg/L的治療濃度范圍內有281份，占83.89%，移植后不同患者他克莫司全血濃度實測值相差較大，說明存在較大的個體差異。因此臨床應針對檢測結果，構建新的治療窗，同時加強與臨床醫生和藥師之間的溝通，能夠為臨床肝和腎移植患者制訂切實、有效、合理的治療方案，最大限度減少肝和腎移植患者臨床用藥的不良反應及排斥反應，提高患者預后[9]。

綜上所述，他克莫司免疫抑制劑血藥濃度測定中CMIA的應用，不僅準確度和精密度較高，同時攜帶污染率及漂移度對CMAI測定結果沒有影響，性能指標可靠性高。另外，應注意由于不同患者個體間的他克莫司吸收和代謝存在差異，因此臨床對患者實施他克莫司治療應定期監測血藥濃度，根據血藥濃度給予患者最佳的劑量，減少毒副反應。

[1]馮艷青,劉振紅,張楊麗.三種他克莫司測定試劑盒測定移植病人全血中他克莫司濃度的比較[J].中國衛生檢驗雜志，2012，22(8)：1993-1996.

[2]于翠霞,樊宏偉,胡云芳.化學發光微粒子免疫法研究甲鈷胺在健康人體內的藥動學和生物等效性[J].中國藥師,2014,17(10):1619-1622.

[3]Muduma G,Shaw J,Hart WM,et al.Odeyemi A3Cost utility analysis of immunosuppressive regimens in adult renal transplant recipients in England and Wales[J].Patient Preference Adherence,2014,4(8):1537-1546.

[4]袁梅,張弋.中藥、中藥成分與常見食物對他克莫司血藥濃度的影響[J].藥品評價,2013,10(16):20-24.

[5]Patel J,Kobashigawa JA.Quest for lower immunosuppression in cardiac transplantation:an analysis of the TICTAC trial[J].Future Cardiol，2011,7(3):293-297.

[6]祁洪剛,翁錫君,任雨,等.腎移植后早期轉換西羅莫司治療對腎小球濾過率影響的臨床觀察[J].現代實用醫學,2012,24(8):891-893.

[7]劉旭華,戚潤鵬.化學發光微粒子免疫法監測他克莫司血藥濃度的臨床應用評價[J].國際檢驗醫學雜志,2011,32(11):1216-1218.

[8]夏寧,劉海菊,范久波.雅培i4000快速測定血漿丙戊酸濃度及在兒科中的應用效果[J].現代中西醫結合雜志,2014,23(2):117-119.

[9]馬連學,李艷菊,魏巍.化學發光微粒免疫法和酶聯免疫吸附法檢測乙肝表面抗原的結果對比分析[J].中國實用醫藥,2014,9(9):89-90.

Effect of CMIA on the determination of tacrolimus

WANGTao

(DepartmentofClinicalLaboratory,AnkangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Ankang,Shaanxi725000,China)

Objective To analyze and evaluate the effect of chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA) on determination of tacrolimus.Methods 60 cases of blood samples were collected from patients received liver or renal transplantation in the First Affiliated Hospital of Xi ′an Jiaotong University,and detected the blood concentration of tacrolimus by CMIA.Architect i2000 automatic immunoassay system was used to detect the quality controls of tacrolimus for 5 d in a row,so as to calculate the slope,nonlinearity,intercept,driftance and contamination rate of tacrolimus fixed value quality control.Results After 5-day continuous detection,the results showed that the deviations between measured values and target values of the quality controls with different tarcrolimus concentrations as well as the coefficient of variation (CV) were within the allowable range.The average intercept,nonlinearity,slope,driftance and contamination rate of 5-day continuous detection were 12.17,0.65,7.62,0.15,and -0.12%,respectively.The differences both of slope and intercept were significant (P<0.05).The contamination rate,nonlinearity,driftance,and the slope correction with calibration factors (median value-low value) had no significantly difference (P>0.05).Among 335 cases of samples,there were 281 cases (83.89%),within the tarcrolimus therapeutic range (3-20 μg/L).Conclusion The CMIA determination of tacrolimus has good tightness and accuracy,and its performance indicators also meet the clinical basic requirements.It is a preferred method for the detection of tacrolimus concentration in blood.

determination of blood drug concentration;chemiluminescent microparticle immunoassay; tacrolimus;precision

汪濤，男，本科，主管檢驗師，主要從事免疫學檢驗。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.021

A

1672-9455(2015)23-3502-03

2015-03-09

2015-06-15)