三維熒光光譜(3D-EEM)技術在溶解性有機質(DOM)分析中的應用

朱大偉，武道吉，孫翠珍，張志斌

(山東建筑大學市政與環境工程學院，山東濟南 250101)

DOM的傳統分析方法通過離子交換樹脂富集后利用核磁共振、紅外光譜等進行分析。采用離子交換樹脂法可以對DOM所有組分進行完全的分離，相關操作模擬自然生態條件進行，但對DOM濃度小于5 mg/L的水樣存在一定的局限性［5］，且重復使用樹脂可能得不到疏水酸性物質(HPOA)，分離組分中也可能會含有微量的雜質［6］，整個試驗過程冗長、樣品消耗量大，分析過程較為復雜。

目前，隨著儀器分析技術的發展，科研人員從光譜學領域出發，逐步推廣采用光譜技術對DOM進行試驗分析。與傳統分析方法相比，三維熒光光譜靈敏度高，比一般分析方法高出2～3個數量級，選擇性較好［7］，樣品消耗量小且不破壞樣品結構，采用該技術分析水樣中DOM效果顯著。

1 三維熒光光譜技術機理

電子激發態的多重度M=2S+1，其中S為電子自旋量子數的代數和(0或1)。自旋配對即分子同一軌道里的兩個電子自旋方向相反。假如激發后電子在躍遷過程中，自旋方向沒有變化，分子中的電子全部是自旋配對，那么此時分子便處于激發的單重態(singlet state)，即S=0。但如果激發后電子在躍遷過程中，自旋方向發生變化，那么分子此時便處于激發的三重態，即S=1。圖1為熒光產生原理的雅布隆斯基分子能級圖，T1代表第一電子激發三重態，S0、S1、S2分別代表分子的基態、第一電子激發單重態(first excited state)和第二電子激發單重態(second excited state)。

圖1 雅布隆斯基分子能級圖Fig．1 Jablonski Diagram

光在照射的過程中被DOM吸收，入射光的能量傳遞給有機物分子。當它被激發后，原子核周圍的一些電子會從較低能級的軌道躍遷至較高能級的軌道，即從基態躍遷至激發態，整個過程約10-15s，而兩個能級間的能量差就是它所吸收的能量。由于激發態是不穩定的，會通過輻射躍遷(發射熒光)或非輻射躍遷(振動弛豫、內轉換和系間竄越)恢復至基態，這樣當電子從激發態恢復到基態時，伴隨著能量以電磁輻射的形式釋放，即產生熒光，這就是3D-EEM技術能夠分析DOM的機理。

三維熒光光譜圖中三維分別是指激發波長、發射波長及對應的熒光強度。它有兩種表現形式，三維熒光投影圖和二維熒光等高線圖，后者較前者能夠克服圖譜中光譜峰遮掩的問題，更豐富地表達光譜峰的位置及熒光強度所揭示的信息。水體中DOM組成不同，濃度不同，它們的三維熒光光譜圖也不盡相同，因此也稱三維熒光光譜技術為“fingerprint”(指紋)技術。

由于水體中DOM是多種有機物組分的混合物，在三維熒光光譜圖中，不同組分的光譜峰位置重疊導致的遮掩會帶來一定的視覺誤差，故采用數學分析方法對三維熒光光譜圖進行處理，如主成分分析法 (principal component analysis， PCA)和PARAFAC，將不同組分的三維熒光光譜圖提取分離出來。

PCA利用降維的思想將三維熒光光譜圖中的數據信息進行分析，提取出幾個新的變量，它們是原變量的線性組合，且能夠最大限度地表征原變量所包含的信息。PARAFAC基于三線性分解理論，采用交替最小二乘方法(alternating least squares method，ALS)實現，它將三維熒光光譜圖分解為多個(一般為3個)獨立的二維熒光光譜圖，以便提高光譜識別的準確性。與PAC相比，PARAFAC的解是唯一的，因而可以避免由于操作人為造成分析結果的誤差［8］。

式中：Δii為托架某次調姿過程中的整體誤差項系數乘以誤差項(即(Tpθ·δpθ)k中某行);f(x1,x3,,x36)為去除結構誤差x2,x22后，其余結構誤差對Δii的影響。線性相關列對應的結構誤差項無法單獨辨識，只能辨識出結構誤差項對托架整體誤差項的綜合影響。同理，可將x3+x24,x4+x30,x5+x36作為單一整體進行求解。因此，令：

2 三維熒光光譜技術的影響因素

根據產生熒光所需的條件，三維熒光光譜技術的影響因素可以分為內部結構跟外部環境兩個方面。

2．1 內部結構

(1)躍遷類型

分子產生熒光主要的躍遷類型為π→π*躍遷。對于大部分的熒光有機物，首先由nπ→π或π→π*激發，然后通過振動弛豫或其他輻射躍遷，發生π*→n或π*π→躍遷從而得到熒光。研究發現，π*π→躍遷能夠得到較強的熒光［9］。

(2)剛性平面結構和共軛效應

熒光現象通常發生在具有剛性平面結構以及電子共軛體系的分子中［10］，芳香族化合物是典型的具有熒光性的物質。有些有機物(如8-羥基喹啉)雖然具有π-π共軛雙鍵，但是不具有剛性平面結構，分子也不處在同一個平面中，這些有機物本身是不會發出熒光的，當它們與金屬離子形成配位聚合物后，由于分子平面結構的增大，分子剛性結構的增強，這些配位聚合物常常也能夠發出熒光。因此ππ共軛雙鍵是物質熒光性的必要條件，π電子的共軛程度與物質的熒光強度成正比關系。

(3)取代基效應

芳香族化合物苯環上的取代基對它的熒光強度有很大的影響。—OH、—CN和—NH2等給電子基團能夠增強熒光強度，而—NO2、—C==O、—COOH和鹵素等吸電子基團則會使熒光強度減弱甚至發生猝滅［11］。

2．2 外部環境

(1)pH

一般來說，在相同溶液環境下，DOM的熒光強度會隨著pH的增加而增大，這主要與結構中的酸性基團和自身隨 pH改變的分子構型有關［12］。GHOSH等［12］發現DOM分子在高pH時呈線性結構，而在低pH時發生卷曲。對于芳香族化合物與金屬離子形成的配位聚合物，pH不但會影響它們的形成，還會影響它們的組成，從而影響到它們的性質。比如，鄰二羥基偶氮苯與Ga3+在pH為3～4的條件下可形成1∶1的配位聚合物，可產生熒光;但在pH為6～7的條件下則會形成1∶2的配位聚合物，不能產生熒光［8］。

(2)溫度

溫度也是影響DOM熒光強度的一個重要因素。李紅軍等［13］進行不同溫度對熒光素鈉溶液熒光強度的測試表明，隨著溫度的降低，DOM的熒光強度和熒光量子效率都會增大，而當溫度升高時，DOM的熒光強度就會降低。這主要是由兩個方面造成的，一是分子內部能量的轉化，二是碰撞的頻率。

(3)金屬離子

DOM與金屬離子形成配位聚合物會因它們之間的相互作用而引起熒光猝滅。在過量Cu(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的條件下，DOM中類富里酸的熒光強度會發生一定的猝滅［14］。傅平青等［15］應用三維熒光光譜技術研究DOM與Hg(Ⅱ)間的相互作用，結果表明在自然水體環境中，Hg(Ⅱ)是DOM的強有機配位體，DOM的熒光基團能夠被Hg(Ⅱ)在一定程度上猝滅。另外，Cu(Ⅱ)也是DOM的熒光猝滅劑。

(4)散射光

這里的散射光主要是指拉曼散射(Raman scattering)和瑞利散射(Rayleigh scattering)。拉曼散射是由于處在激發態的分子沒有躍遷至基態而偏離原來的能級，到達稍高或稍低的能級。瑞利散射與水體中粒子的濃度和體積有關。去除散射光影響的辦法主要有加權法、空白去除法和插值法等。

(5)溶劑效應

溶劑的影響分為一般溶劑效應和特殊溶劑效應。一般溶劑效應是指溶劑的介電常數n與折射率ε對熒光強度的影響。特殊溶劑效應是指熒光物質與溶劑間的化學作用，它對熒光強度的影響會大于一般溶劑效應［9］。肖雪等［16］研究了溶劑效應對苯酚三維熒光光譜特性的影響，結果表明苯酚的光譜峰位置并未隨溶劑的改變而發生明顯位移，而熒光強度則有顯著差異，在純乙醇中的苯酚熒光強度大于在純水中的苯酚熒光強度。

3 三維熒光光譜定性分析

不同的有機物組分都有其特定的最大激發波長和發射波長，因此可以根據對應的光譜峰位置實現對熒光組分的定性分析，它包含了與有機物結構、動力學、官能團等有關的大量信息［17］。常見的有機物光譜峰位置如表1所示。

表1 三維熒光光譜技術常見有機物光譜峰識別位置Tab．1 Summary of Fluorescent Peak Position of Organic Matter by 3D-EEM

4 三維熒光光譜技術應用現狀與展望

祝鵬等［23］利用PARAFAC對太湖水樣的三維熒光光譜圖進行處理，通過對得到的DOM各種組分的光譜峰值與原始三維熒光光譜中各種組分光譜峰值進行比較，可以認為在進行分析時，利用前者代替后者是可行的。施俊等［24］采用3D-EEM技術分析污水處理廠進出水水質，通過擬合進出水中的光譜峰處的熒光強度與常規指標間的關系，發現λEx/Em=225/340和λEx/Em=230/430處可以用來對城市生活污水中銨態氮和總氮進行在線分析和實時監測。郝瑞霞等［25］采用3D-EEM技術研究了生活污水中DOM的熒光特性，發現光譜峰處的熒光強度與TOC或COD都有良好的線性關系。吳靜等［26］基于3D-EEM技術分析北京城市水體，研究表明三維熒光光譜圖可以展示污染的程度及污染來源。宋曉娜等［27］利用3D-EEM研究太湖表層和底層水體DOM組成和分布，對不同湖區DOM的來源進行分析，結果表明大部分湖區水體的DOM以類蛋白質為主，DOM的分布存在區域差異性，并且光譜峰處的熒光強度與各類水質常規指標呈顯著相關性。閆麗紅［28］對黃東海春秋季水樣進行表、中、底層有色可溶性有機物(colored dissolved organic matter，CDOM)進行了分析，研究表明3D-EEM能夠鑒別出黃東海水體CDOM中有10種熒光組分，CDOM發色團與類腐殖質組分有相似性質，CDOM的組成和性質具有明顯的季節性變化和遷移轉化。黃昌春等［29］基于太湖全湖樣點的CDOM三維熒光光譜數據，結合后平行因子分析法研究CDOM的組成成分及其熒光光譜特征，研究結果根據熒光基團的類別，將太湖的CDOM源類型分為四類，即(1)陸源主導類型;(2)偏陸源主導類型;(3)偏海源主導類型;(4)海源主導類型。

目前國內外對三維熒光光譜技術的研究大多處于實驗室階段，這可能是由以下幾個方面的原因造成的。(1)尚有未知的組分來源及特征不確定;(2)PARAFAC還需要有進一步驗證與探索的必要;(3)暫時還沒有統一的DOM組分熒光特性指標的標準［30］。為了使三維熒光光譜技術能夠更廣泛地應用于實際問題，今后的研究重點應該從以下幾個方面來考慮:(1)利用現代化先進儀器分析設備，更為深入地研究DOM組分;(2)進一步研究PARAFAC，推動三維熒光光譜技術與PARAFAC的聯用;(3)建立DOM三維熒光光譜指紋數據庫，為將來快速識別分析研究提供幫助。

5 結語與展望

三維熒光光譜技術與PARAFAC聯用是研究水體中DOM的有效手段，對DOM分析具有經濟、高效、選擇性好、靈敏度高且不破壞樣品結構等優點，尤其是在處理水樣中低濃度DOM方面，有廣闊的應用前景。

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