孟魯司特對(duì)失血性休克復(fù)蘇致急性肺損傷大鼠血清TNF-α、IL-6的影響及肺保護(hù)作用

田 剛，涂青梅，鄭 敏，姜禎珍，羅興均，趙 翔

(1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

孟魯司特對(duì)失血性休克復(fù)蘇致急性肺損傷大鼠血清TNF-α、IL-6的影響及肺保護(hù)作用

田 剛1，涂青梅2，鄭 敏1，姜禎珍1，羅興均1，趙 翔1

(1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

目的 觀察孟魯司特對(duì)失血性休克復(fù)蘇致急性肺損傷大鼠血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的影響，探討孟魯司特的肺保護(hù)作用機(jī)制。方法 選取健康成年大鼠24只，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham組)；失血性休克復(fù)蘇致急性肺損傷模型組(HS組)和孟魯司特治療組(M組)，每組8只。除Sham組外，其余2組動(dòng)物制備失血性休克復(fù)蘇急性肺損傷模型。M組大鼠在放血前30 min給予孟魯司特7 mg/kg腹腔內(nèi)注射，在再灌注之前以同樣的劑量再注射1次。Sham組和HS組均給予等量的乙醇溶液腹腔內(nèi)注射。計(jì)算肺組織濕干質(zhì)量之比(W/D)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒定量測(cè)定血清TNF-α和IL-6含量；肺組織取樣進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果 與Sham組比較，HS組肺組織W/D明顯增大(P<0.05)，血清TNF-α、IL-6水平明顯升高(P均<0.05)，肺組織病理改變?yōu)橹卸确螕p傷。與HS組比較，M組肺組織W/D明顯減小(P<0.05)，血清TNF-α、 IL-6水平明顯降低(P均<0.05)，肺組織病理改變明顯減輕，為輕度肺損傷。結(jié)論 孟魯司特能夠減輕失血性休克復(fù)蘇大鼠血清TNF-α、IL-6水平的升高，從而減輕肺損傷，具有一定的肺保護(hù)作用。

失血性休克；急性肺損傷；孟魯司特；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素-6

失血性休克(HS)是一種常見(jiàn)的并發(fā)癥，由嚴(yán)重的外傷或手術(shù)創(chuàng)傷引起。失血性休克復(fù)蘇(HSR)也被認(rèn)為是一種損傷，因?yàn)樗梢越?jīng)常引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，結(jié)果可能會(huì)導(dǎo)致多臟器功能障礙綜合征(MODS)，其中包括急性肺損傷(ALI)。ALI是臨床醫(yī)生面臨的主要問(wèn)題，導(dǎo)致發(fā)病率和病死率明顯升高[1]。HS引起的SIRS的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，與很多病理生理機(jī)制都有關(guān)系。目前被絕大多數(shù)人接受和認(rèn)可的機(jī)制是缺血再灌注(I/R)以及對(duì)自身免疫細(xì)胞的刺激[2]。I/R是導(dǎo)致缺血復(fù)蘇后氧化應(yīng)激和SIRS發(fā)生的主要因素。中性粒細(xì)胞是參與HSR后急性肺炎的主要細(xì)胞因素。研究表明，HS后中性粒細(xì)胞被激活，并且中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的積聚增加與肺損傷關(guān)系密切[3]。作為一種具有選擇性和可逆性的半胱氨酰白三烯1(CysLT1)受體拮抗劑，孟魯司特常被用于治療過(guò)敏性鼻炎和哮喘[4]。通過(guò)中性粒細(xì)胞依賴(lài)機(jī)制，孟魯司特可以改善發(fā)熱和膿毒血癥引起的多器官損害[5]。此外，由于其具有抗炎抗氧化作用，可減輕I/R引起的多種臟器如肝臟、腸、腎臟、睪丸和膀胱的氧化損傷。但孟魯司特對(duì)HSR所致ALI的影響和作用尚少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在觀察孟魯司特對(duì)HS大鼠血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)的影響，探討孟魯司特的肺保護(hù)作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選擇成年健康SD大鼠(SPF級(jí))24只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄不限，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：No.00031071。將其隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、失血性休克復(fù)蘇致急性肺損傷模型組(HS組)、孟魯司特治療組(M組)，每組8只。Sham組：在相同的時(shí)間內(nèi)接受相同的麻醉和手術(shù)過(guò)程成為休克動(dòng)物，但既不是失血性休克也不進(jìn)行液體復(fù)蘇；HS組：經(jīng)過(guò)心臟內(nèi)穿刺緩慢放血1 h，失血量約為50%(30 mL/kg)，失血性休克后再用林格氏液復(fù)蘇1 h，然后一直保留到實(shí)驗(yàn)結(jié)束；M組：在放血前30 min接受孟魯司特7 mg/kg腹腔內(nèi)注射，在再灌注之前以同樣的劑量再注射1次。Sham組和HS組均給予等量的乙醇溶液腹腔內(nèi)注射。

1.2HS模型的建立 用10%水合氯醛350 mg/kg經(jīng)大鼠腹腔注射麻醉。從左側(cè)胸部進(jìn)行心臟內(nèi)穿刺，放血時(shí)間2 min以上，放血量為50%(30 mL/kg),大鼠處于休克狀態(tài)持續(xù)時(shí)間為1 h，之后通過(guò)尾部靜脈輸注乳酸林格氏溶液進(jìn)行復(fù)蘇，輸液量為失血量的2倍(60 mL/h)，輸液時(shí)間1 h以上。除了不放血和不復(fù)蘇之外，Sham組進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn)程序。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大鼠均保持自主呼吸。復(fù)蘇后2 h，大鼠被再次麻醉后從胸腔打開(kāi)處放血處死，直接從心臟抽取血液樣本。保留肺組織，右肺用于測(cè)定含水量；左肺用10%甲醛固定進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.3肺組織含水量測(cè)定 于以上時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，開(kāi)胸取右肺上葉，用吸水紙吸干表面水分及血液后稱(chēng)其質(zhì)量，為濕質(zhì)量，然后將其置于60 ℃烘箱中干燥72 h稱(chēng)其質(zhì)量，為干質(zhì)量，計(jì)算肺濕/干質(zhì)量比(W/D)。

1.4血液樣本的制備和炎性細(xì)胞因子檢測(cè) 每只大鼠的心臟收集3 mL血液。血液取樣在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行(復(fù)蘇完成后2 h)。血液樣本凝固在37 ℃，然后以3 000 r/min離心15 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒定量測(cè)定血清TNF-α和IL-6含量。

1.5組織取樣及組織病理學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死大鼠并取肺組織，用10%甲醛緩沖液立即固定所有組織病理學(xué)標(biāo)本，進(jìn)行常規(guī)處理，顯微鏡下觀察部分標(biāo)本的組織病理學(xué)改變。采用Matute-Bello等創(chuàng)立的評(píng)分系統(tǒng)對(duì)肺損傷程度進(jìn)行評(píng)估。該評(píng)分系統(tǒng)對(duì)肺泡間質(zhì)內(nèi)充血、肺泡內(nèi)細(xì)胞浸潤(rùn)以及肺泡出血進(jìn)行分級(jí)，每項(xiàng)指標(biāo)被分為0～3級(jí)。肺泡間質(zhì)細(xì)胞分級(jí)：肺間質(zhì)細(xì)胞稀少為0級(jí)；肺間質(zhì)細(xì)胞<1/3視野為1級(jí)；肺間質(zhì)細(xì)胞占據(jù)1/3～2/3視野為2級(jí)；肺間質(zhì)細(xì)胞>2/3視野為3級(jí)。肺泡內(nèi)細(xì)胞浸潤(rùn)：每視野肺泡內(nèi)皮細(xì)胞<5個(gè)為0級(jí)；每視野肺泡內(nèi)皮細(xì)胞5～10個(gè)為1級(jí)；每視野肺泡內(nèi)皮細(xì)胞10～20個(gè)為2級(jí)；每視野肺泡內(nèi)皮細(xì)胞>20個(gè)為3級(jí)。肺泡出血分級(jí)：沒(méi)有出血為0級(jí)；1～5個(gè)肺泡中，每個(gè)肺泡至少5個(gè)紅細(xì)胞為1級(jí)；5～10個(gè)肺泡中，每個(gè)肺泡至少5個(gè)紅細(xì)胞為2級(jí)；>10個(gè)肺泡中，每個(gè)肺泡至少含5個(gè)紅細(xì)胞為3級(jí)。單項(xiàng)指標(biāo)得分相加，得到總的肺損傷評(píng)分。依據(jù)評(píng)分，肺損傷被分為3級(jí)：0分為正常，1～3分為輕度；4～6分為中度；7～9分為重度。組織學(xué)切片由病理科醫(yī)生觀察評(píng)估。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺組織含水量的變化 Sham組、HS組、M組W/D值分別為4.11±0.14，5.85±0.35，4.53±0.39，HS組、M組肺組織W/D值較Sham組明顯增大(P<0.05)，M組較HS組比較明顯減小(P<0.05)。

2.2各組大鼠血清TNF-α、 IL-6水平比較 與Sham組相比另兩組大鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯升高(P<0.05)；與HS組相比，M組大鼠血清TNF-α、 IL-6水平明顯降低(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平比較

注：①與Sham組比較,P<0.05；②與HS組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠肺組織病理學(xué)分級(jí)情況比較 Sham組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)無(wú)水腫、炎癥肺泡大小形態(tài)均勻，見(jiàn)圖1。HS組肺泡間隔水腫增厚，肺泡腔內(nèi)有明顯的出血、滲出，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2。M組肺泡間隔清晰，肺泡腔內(nèi)的出血、滲出以及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減輕。見(jiàn)圖3。肺損傷評(píng)分顯示，HS組中度肺損傷5只(62%)中重度肺損傷3只(38%)；M組大鼠肺損傷明顯減輕，肺組織正常2只(25%)，輕度肺損傷5只(62%)，中度肺損傷1只(12%)。

圖1 Sham組光鏡下肺葉組織病理學(xué)改變(HE染色，×200)

圖2 HS組光鏡下肺葉組織病理學(xué)改變(HE染色，×200)

圖3 M組光鏡下肺葉組織病理學(xué)改變(HE染色，×200)

3 討 論

目前的研究表明，HS會(huì)引起生化和組織學(xué)變化，從而導(dǎo)致ALI的發(fā)生[6]。孟魯司特可以阻止HS后的生化改變，對(duì)肺組織有保護(hù)作用。白三烯與其他組織的I/R損傷關(guān)系密切，但是關(guān)于HS誘發(fā)的肺損傷與脂氧合酶5通路產(chǎn)物關(guān)系的研究目前還較少。

HS常導(dǎo)致SIRS，包括促炎細(xì)胞因子的系統(tǒng)性釋放，而促炎細(xì)胞因子又是炎癥反應(yīng)的核心。之前的研究表明，創(chuàng)傷性失血發(fā)生后，體內(nèi)IL-6和TNF-α的水平明顯增高，且可以維持?jǐn)?shù)小時(shí)[3]，這與Vincenzi等[7]的研究結(jié)果一致，他們也發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，休克大鼠體內(nèi)IL-6和TNF-α的水平顯著增高。被激活的炎癥細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，已被證實(shí)在復(fù)蘇性休克引起的SIRS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了關(guān)鍵角色，他們也是炎性細(xì)胞因子的主要來(lái)源，包括IL-6和TNF-α。Sener等[8]已證實(shí)，在腎臟I/R模型中，與誘導(dǎo)未治療組相比，孟魯司特明顯降低了大鼠血漿中TNF-α和IL-6的水平。Maeba等[9]證實(shí)，通過(guò)抑制NF-κB激活，大劑量孟魯司特可以調(diào)節(jié)IL-6和TNF-α的生成。CysLT受體阻滯劑可以抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中應(yīng)用CysLT受體拮抗劑治療，可明顯減低IL-6水平。對(duì)膿毒血癥引起的多器官損傷大鼠，孟魯司特可以降低其血清中TNF-α的水平[5]。此外，Kabasakal等[10]研究表明孟魯司特可以顯著減少發(fā)熱引起的氧化應(yīng)激腸道損傷大鼠體內(nèi)的TNF-α血清水平。本研究結(jié)果顯示，與HS組相比，孟魯司特可以明顯降低HS大鼠體內(nèi)IL-6和TNF-α水平，提示孟魯司特對(duì)HS引起的ALI有保護(hù)作用。

形態(tài)學(xué)上，HS組總評(píng)分提示中度肺損傷，其中66%為中度肺損傷，33%為重度肺損傷。與HS組相比，孟魯司特對(duì)大鼠的治療明顯減輕了肺損傷，M組的總評(píng)分提示輕度肺損傷。雖然沒(méi)有數(shù)據(jù)表明孟魯司特對(duì)HS大鼠肺實(shí)質(zhì)有保護(hù)作用，但Sener等[11]證實(shí)孟魯司特的治療可以改善退化的肺上皮細(xì)胞，明顯降低慢性腎衰竭引起的多器官損傷大鼠肺部炎癥細(xì)胞的數(shù)量。此外，孟魯司特可預(yù)防發(fā)熱引起的肺損傷，因?yàn)槠淇梢愿纳品伍g質(zhì)出血引起的大量肺泡結(jié)構(gòu)紊亂和消失[12]。以I/R為模型的各種研究表明，孟魯司特可以延緩不同器官的組織病理學(xué)變化，包括肝臟、腎臟和睪丸[5]。本研究中，孟魯司特的抑制作用主要?dú)w因于其平衡氧化-抗氧化狀態(tài)的能力以及減少促炎遞質(zhì)的產(chǎn)生，也可能抑制了中性粒細(xì)胞的激活和滲透。

綜上所述，孟魯司特能夠降低HSR大鼠血清TNF-α、IL-6水平，從而減輕肺損傷，具有一定的肺保護(hù)作用。

[1] 廖志林. 急性肺損傷與失血性休克相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2013,26(11)：136-139

[2] 豐浩榮，葛偉，許鵬程. 氯胺酮治療急性肺損傷研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013,32(8):1049-1052

[3] 鄭敏，田剛，顧俊峰，等. 氯胺酮對(duì)失血性休克大鼠肺TNF-α、NF-κB的影響及保護(hù)作用[J]. 湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，31(2)：197-200

[4] 魯洪香，徐恩道，凌杰. 孟魯司特治療咳嗽變異性哮喘的療效及預(yù)防復(fù)發(fā)作用[J]. 中國(guó)藥師，2014,17(3):483-485

[5] Sener G,Sehirli O,?etinel S,et al. Amelioration of sepsis-induced hepatic and ileal injury in rats by the leukotriene receptor blocker montelukast[J]. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2010，73:453

[6] Al-Amran FG,Hadi NR,Hashim AM. Leukotriene biosynthesis inhibition ameliorates acute lung injury following hemorrhagic shock in rats[J]. Cardiothorac Surg,2011,6:81

[7] Vincenzi R,Cepeda LA,Piyani WM,et al. Small volume resuscitation with 3% hypertonic saline solution decrease inflammatory response and attenuates end organ damage after controlled hemorrhagic shock[J]. Am J Surg,2009,198(3):407-414

[8] Sener G,Sehirli O,Veliolu-Oqünc A,et al. Montelukast protects against renal ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Pharmacol Res，2012，54(1):65[9] Maeba S,Ichiyama T,Ueno Y,et al. Effect of montelukast on nuclear factor kappaB activation and pro-inflammatory molecules[J]. Ann Allergy Asthma Immunol，2005，94:670-674

[10] Kabasakal L,Sener G,Cetinel S,et al. Burn-induced oxidative injury of the gut is ameliorated by the leukotriene receptor blocker montelukast[J]. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2008，72(6):431-440

[11] Sener G,Sakarcan A,Sehirli ?,et al. Chronic renal failure-induced multiple-organ injury in rats is alleviated by the selective CysL T1 receptor antagonist montelukast[J]. Prostaglandins Other Lipid Mediat，2011，83(4):257-267

[12] Souza DG,Pinho V,Cassali GD,et al. Effect of a BLT receptor antagonist in a model of severe ischemia and reperfusion injury in the rat[J]. Eur J Pharmacol，2007，440(1):61-69

Effects of montelukast on serum TNF-α and IL-6 levels in rats with hemorrhagic shock followed by resuscitation induced acute lung injury and lung protective effect

TIAN Gang1，TU Qingmei2, ZHENG Min1，JIANG Zhenzhen1，LUO Xingjun1， ZHAO Xiang1

(1.Renmin Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China; 2.Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to investigate the effects of montelukast on serum TNF-α and IL-6 levels in rats with hemorrhagic shock followed by resuscitation induced acute lung injury and discuss montelukast lung protection mechanism. Methods Twenty-four normal rats were randomly divided into 3 groups(n=8 each): sham operation group (sham group), hemorrhagic shock followed by resuscitation group(HS group), montelukast treatment group (M group). Except the rats in sham group, rest rats were made into hemorrhagic shock followed by resuscitation models with lung injury. The rats in M group received a montelukast 7 mg/kg intraperitoneal injection 30 min before the induction of hemorrhagic shock, with the same dose repeated just before the reperfusion period. Both sham and HS group rats received the same volume of the ethanol carrier solution. The ratio of lung wet dry weight was calculated; quantitative determination of serum TNF-α and IL-6 was performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit; lung tissue sampling was gotten for histopathological examination. Results The lung tissue W/D obviously increased, the TNF-α and IL-6 serum levels were significantly highe, lung tissue pathology change for moderate lung injury in the HS group when compared with the sham group (P<0.05). The lung tissue W/D obviously decreased, the TNF-α and IL-6 serum levels were significantly lower, lung tissue pathology change for mild lung injury in the M group when compared with the HS group (P<0.05). Conclusion Montelukast could significantly reduce the elevation of serum TNF-α and IL-6 levels in the hemorrhagic shocked rats, thus reduce the lung injury, which suggested that montelukast had a protective effect in haemorrhagic shock induced acute lung injury.

hemorrhagic shock； acute lung injury； montelukast； TNF-α； IL-6

田剛，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)閲g(shù)期器官保護(hù)。

鄭敏，E-mail: lhj1286@163.com

湖北省十堰市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2011066)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.02.005

R-332

A

1008-8849(2015)02-0129-04

2014-07-05