不同劑量右美托咪定對大鼠全腦缺血再灌注損傷腦保護作用的研究

徐 雪，蔡勁松，戚 翔，張 山，梁 治，閆 靜，李 雪

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

不同劑量右美托咪定對大鼠全腦缺血再灌注損傷腦保護作用的研究

徐 雪，蔡勁松，戚 翔，張 山，梁 治，閆 靜，李 雪

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

目的 觀察不同劑量右美托咪定對大鼠全腦缺血再灌注損傷的影響，探討其神經(jīng)保護作用及可能機制。方法 將健康雄性SD大鼠40只隨機分為假手術(shù)組(S組),全腦缺血再灌注對照組(C組),低、中、高劑量右美托咪定組(D1組、D2組、D3組)，每組8只。采用四血管阻塞法制備全腦缺血再灌注模型。缺血即刻S組和C組靜脈輸注生理鹽水2 mL/h；D1組、D2組、D3組分別靜脈輸注右美托咪定0.05,0.5，5 μg/(kg·min),各組均持續(xù)輸注2 h。于缺血再灌注后24 h用平衡木法和引體實驗測定各組大鼠運動功能，干濕質(zhì)量法測定各組大鼠腦組織含水量，ELISA法檢測各組大鼠血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)的水平。結(jié)果 與S組比較，C組和D1組、D2組、D3組大鼠運動功能均顯著下降(P均<0.05),腦水含量顯著增加(P均<0.05),血清TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P均<0.05)。與C組比較，D1組、D2組、D3組血清TNF-α、IL-1β水平均明顯下降(P均<0.05)；D1組對IL-1β的抑制作用強于D2組和D3組(P均<0.05)，D2組和D3組比較差異無統(tǒng)計學意義；D1組、D2組、D3組對TNF-α的抑制作用差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 0.05 μg/(kg·min)右美托咪定對大鼠全腦缺血再灌注損傷有腦保護作用，可顯著改善大鼠運動功能，其機制可能與抑制炎性因子有關(guān)。5 μg/(kg·min) 右美托咪定未顯示出顯著的腦保護效應(yīng)。

全腦缺血再灌注；右美托咪定；運動功能；腫瘤壞死因子α；白細胞介素-1β

腦血管疾病嚴重威脅著人們的身體健康，其發(fā)病率、病死率及致殘率有逐年上升的趨勢。臨床上在神經(jīng)外科、心臟及大血管、老年和危重病等高風險手術(shù)中，圍術(shù)期均存在潛在的腦缺血危險，因此如何預(yù)防圍術(shù)期間腦血管并發(fā)癥日益受到關(guān)注[1]。右美托咪定(DEX)是一種新型的高選擇性高特異性的α2-腎上腺素能受體激動劑，具有劑量依賴性鎮(zhèn)靜、抗焦慮、鎮(zhèn)痛、抑制交感活性及無呼吸抑制等藥理性質(zhì)[2]。美國藥品與食品管理局(FDA)于1999年批準，將其應(yīng)用于成人重癥監(jiān)護病房(ICU)短時間(24 h)的鎮(zhèn)靜與鎮(zhèn)痛，近年來該藥逐漸作為輔助鎮(zhèn)靜藥物應(yīng)用于臨床麻醉管理和重癥監(jiān)測治療中[3-4]。基礎(chǔ)研究表明，DEX對腦損傷有顯著神經(jīng)保護作用[5-7]，可能與其降低細胞外兒茶酚胺水平、減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸及調(diào)節(jié)細胞凋亡等有關(guān)[8]。本實驗進一步研究了DEX是否具有劑量依賴性的腦保護作用，旨在為圍術(shù)期具有發(fā)生潛在腦缺血的高危手術(shù)患者合理用藥提供實驗依據(jù)。

1 實驗資料

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠，周齡8～12周，體質(zhì)量180～320 g，動物合格證號： 2010-0011，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗前適應(yīng)環(huán)境3 d，室溫23 ℃，晝夜交替。

1.2實驗動物分組和模型制備 實驗大鼠40只，隨機分為假手術(shù)組(S組),全腦缺血再灌注對照組(C組),低、中、高劑量DEX組(D1組、D2組、D3組)，每組8只。采用Pulsinelli等[5]的四血管閉塞法并加以修改建立大鼠全腦缺血模型。大鼠實驗前24 h禁食不禁水，腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)，麻醉成功(翻正反射消失，鉗夾尾部無體動反應(yīng))后,俯臥位固定在操作臺上。于枕骨后第1—2頸椎處做一切口，沿中線分開縱向的肌肉。以第1頸椎棘突為標志，分離暴露第1頸椎雙側(cè)翼狀孔，直視下用電凝燒灼凝閉雙側(cè)椎動脈，造成其永久性關(guān)閉。在切口處滴注慶大霉素2滴防止感染，縫合切口，清醒后放回籠中飼養(yǎng)。24 h后同樣方法麻醉大鼠，仰臥位固定，暴露股動脈，穿刺置管監(jiān)測直接動脈壓。頸部正中切口，鈍性分離頸部肌肉，暴露雙側(cè)頸總動脈穿線備用。尾靜脈穿刺置管，接微量泵以備輸入DEX或生理鹽水。采用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，造成動物全腦缺血，10 min后松開動脈夾，恢復腦血流灌注，在切口處滴注慶大霉素2滴防止感染，縫合，清醒后放回籠中飼養(yǎng)。模型制備成功標志為血流阻斷后1 min內(nèi)瞳孔散大，顏色蒼白，對光反射消失，呼吸加快，恢復血流灌注后，瞳孔顏色立即變?yōu)轷r紅色。S組大鼠僅接受假手術(shù)，不凝閉雙側(cè)椎動脈，不阻塞雙側(cè)頸動脈，不造成全腦缺血，術(shù)中予以持續(xù)靜脈泵注生理鹽水2 h，輸注速度2 mL/h。C組全腦缺血8 min，在缺血即刻予以持續(xù)靜脈泵注生理鹽水2 h，輸注速度2 mL/h。D1組全腦缺血即刻予以DEX首次劑量6 μg/kg 10 min內(nèi)靜脈輸注，剩余劑量以0.05 μg/(kg·min)持續(xù)靜脈泵注2 h，輸注速度2 mL/h(DEX用生理鹽水稀釋)。D2組全腦缺血即刻予以DEX首次劑量(60 μg/kg)10 min內(nèi)靜脈輸注，剩余劑量以0.5 μg/(kg·min)持續(xù)靜脈泵注2 h，輸注速度2 mL/h(DEX用生理鹽水稀釋)。D3組全腦缺血即刻予以DEX首次劑量600 μg/kg 10min內(nèi)靜脈輸注，剩余劑量以5 μg/(kg·min)持續(xù)靜脈泵注2 h，輸注速度2 mL/h(DEX用生理鹽水稀釋)。

1.3檢測指標

1.3.1大鼠運動功能測定 各組大鼠在缺血再灌注24 h后，分別采用Combs等[9]的平衡試驗和引體試驗進行運動功能評估，每項測試進行2次，選最好的一次成績計分，每項測試間隔2～3 min，以避免疲勞影響。大鼠運動功能評分標準：平衡測試中不能平衡計0分，維持10 s計1分，維持11～20 s計2分，維持21～30 s計3分；引體測試中堅持0～2 s計0分，堅持3～4 s計1分，堅持5 s第三肢不能搭上計2分，堅持5 s可將第三肢搭上計3分。

1.3.2腦水含量測定 各組實驗動物在再灌注24 h麻醉后，立即斷頭取腦，取左側(cè)大腦經(jīng)電子天平精確稱質(zhì)量后，放入110 ℃恒溫干燥箱烘烤24 h至恒重(兩次稱質(zhì)量差別<0.2 mg)后，用同一電子天平再精確稱干腦組織質(zhì)量，并按照eliot干濕質(zhì)量法計算腦組織含水量，以百分率表示。腦含水量(%)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.3.3血清白細胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)測定 各組大鼠在全腦缺血再灌注24 h后麻醉，經(jīng)右心室采血3 mL，立即離心，3 000 r/min，15 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中保存待測。分別按照相應(yīng)ELISA檢測試劑盒說明書進行測定。試劑盒由上海源葉生物科技有限公司，批號：41588；41721。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠運動功能比較 與S組比較，C組和D1組、D2組、D3組大鼠平衡和引體試驗評分均明顯下降(P均<0.05)；D1組、D2組、D3組平衡試驗評分與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，D1組引體試驗評分升高(P<0.05)，D2組和D3組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠運動功能測定評分分)

注：①與S組比較，P<0.05；②與C組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠腦水含量比較S組(77.28±0.30)%，C組(79.56±0.82)%，D1組(78.43±0.41)%，D2組(79.15±0.71)%，D3組(79.71±0.1)%。與S組比較，C組、D1組、D2組、D3組大鼠腦組織含水量均明顯升高(P均<0.05)；D1組、D2組、D3組腦組織含水量與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3各組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較 與S組比較，C組和D1組、D2組、D3組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P均<0.05)；與C組比較，D1組、D2組、D3組TNF-α、IL-1β水平明顯下降(P均<0.05)；D1組對IL-1β的抑制作用強于D2組和D3組(P均<0.05)，D2組和D3組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；D1組、D2組、D3組對TNF-α的抑制作用差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組血清TNF-α、IL-1β水平比較

注：①與S組比較，P<0.05；②與C組比較，P<0.05；③與D1組比較，P<0.05。

3 討 論

在臨床工作中，當患者發(fā)生嚴重低血壓、休克、心搏驟停等情況時，雖然經(jīng)搶救心肺功能基本恢復，甚至意識也能有不同程度的恢復，但隨之有可能會再度出現(xiàn)意識障礙，有的甚至導致心肺功能再次衰竭，最終結(jié)果是植物人、或遺留精神及智力障礙、或因多臟器功能衰竭而死亡等，這是由于腦缺血再灌注損傷所致。因此，對腦缺血再灌注損傷的防治對于降低這類患者的傷殘率及病死率具有重要的醫(yī)學和社會意義。

本研究所采用的四血管閉塞法效果確切，可較好地模擬臨床上因嚴重低血壓、休克、心肺腦復蘇等造成的全腦缺血性損傷過程，且操作相對簡單，是公認的研究全腦缺血的適宜模型[10]。

DEX是一種新型的α2-腎上腺素能受體激動劑，對α2受體具有高選擇性、高特異性：受體選擇性(α2∶α1)為1 620∶1，為可樂定的8倍。其半衰期也較可樂定短，分布半衰期大約為6min，消除半衰期大約為2h，藥代動力學方面的可預(yù)測性更強。2009年底我國食品藥品管理局批準其用于行全身麻醉時的誘導和機械通氣時的鎮(zhèn)靜。本研究進一步研究了DEX腦保護作用是否與用藥不同的劑量相關(guān)。

全腦缺血可導致不同程度的神經(jīng)功能缺失，運動功能是檢測大鼠神經(jīng)功能的重要指標。Combs評分系統(tǒng)通過特定的運動功能評分工具及評分標準對大鼠進行統(tǒng)一評分，得出相應(yīng)數(shù)據(jù)，通過所得分數(shù)的高低客觀反映神經(jīng)功能情況，可避免主觀偏倚的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，DEX可一定程度改善全腦缺血大鼠的運動功能，且以低劑量組明顯。

腦缺血再灌注損傷是由多種因素參與的復雜病理生理過程，主要包括自由基損傷、興奮性氨基酸毒性、膜脂質(zhì)過氧化、炎性反應(yīng)、鈣超載等[11]。炎性反應(yīng)是機體對抗外界損傷、維持內(nèi)環(huán)境的自我保護機制，然而其又是導致機體組織損傷的重要原因。大量研究已經(jīng)證實，腦缺血后強烈的炎性反應(yīng)是造成腦組織繼發(fā)性損傷的主要因素之一，在此炎性反應(yīng)過程中，多種因素互相作用，共同引起再灌注損傷[12]。腫瘤壞死因子是目前已知的主要炎性細胞因子之一，可分為TNF-α和TNF-β2種，其中TNF-α是具有廣泛生物學特性的多肽類細胞因子，主要由活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生，腦組織中小膠質(zhì)細胞、星形細胞及神經(jīng)元亦可分泌，主要參與機體炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答。正常情況下，它具有抗感染、抗腫瘤和促進組織修復等作用，對機體有利。若病理狀態(tài)下持續(xù)釋放，則會引起組織損傷。TNF-α可通過上調(diào)白細胞和血管內(nèi)皮細胞上的黏附因子(如ICAM-1)的表達，加速炎性細胞進入神經(jīng)組織，加劇腦內(nèi)炎性反應(yīng)；可促進一氧化氮合酶(NOS)表達，產(chǎn)生過量NO，并誘導其他自由基生成，加劇氧化損傷[13]；刺激興奮性氨基酸釋放，激活腦缺血后NMDA和非NMDA受體及Ca2+超載損傷的級聯(lián)反應(yīng)；還可直接破壞血腦屏障，使其通透性增加，造成血管源性腦水腫，從而引起腦細胞特別是星形膠質(zhì)細胞腫脹和變性。

IL-1β是目前研究最多的IL-1的亞類，是觸發(fā)炎癥和免疫反應(yīng)的主要遞質(zhì)，可通過促進白細胞和內(nèi)皮細胞黏附而激發(fā)炎性反應(yīng)。IL-1β作為一種炎性細胞的強烈趨化因子和免疫源性細胞因子，不僅能協(xié)同其他細胞因子促進B、T細胞活化，還能誘導其他炎性遞質(zhì)的產(chǎn)生及黏附分子的表達，進而增加白細胞浸潤，促進NOS產(chǎn)生，使NO合成增加，誘導自由基和興奮性氨基酸生成，啟動多種細胞因子級聯(lián)反應(yīng)，最終引起神經(jīng)元損傷。缺血性腦損傷后TNF-α和IL-1β表達明顯增高，它們的表達水平可作為衡量腦損傷后繼發(fā)性炎性反應(yīng)程度的重要指標[14]。

本實驗結(jié)果顯示，大鼠全腦缺血再灌注后血清中TNF-α、IL-1β水平較假手術(shù)組明顯升高，經(jīng)DEX處理后可以顯著降低二者水平，且以小劑量組最明顯。由此提示，DEX可以通過降低炎性遞質(zhì)的水平，抑制炎性反應(yīng)對腦缺血再灌注損傷起保護作用。其中0.05μg/(kg·min)DEX對大鼠全腦缺血再灌注損傷有一定保護作用，可明顯改善運動功能，其保護機制可能與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)，高劑量組未顯示處顯著的腦保護作用。

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Study on the cerebral protection effects of different dosage of Dexmedetomidine on global cerebral ischemic-reperfusion injury in rats

XU Xue, CAI Jinsong, QI Xiang, ZHANG Shan， LIANG Zhi, YAN Jing, LI Xue

(The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Heibei，China)

Objective It is to observe the effects of different doses of Dexmedetomidine on global cerebral ischemic-reperfusion injury in rats, and to investigate its neuroprotective effect and possible mechanism. Methods 40 male SD rats were randomly divided into 5 groups(n=8 each): sham operation group(group S),ischemic-reperfusion control group(group C),low,median and high doses of Dexmedetomidine groups(group D1-3). Global cerebral ischemic-reperfusion was induced by four-vessel occlusion.In group D1-3,immediately after ischemic, Dexmedetomidine 0.05,0.5 and 5 μg/(kg·min) were infused over 2 h respectively,while normal saline 2 mL/h were given instead of Dexmedetomidine in group S and C. The motor activity tests(beam-walking test and pull-up test) were carried out 24 h after reperfusion. The brain water content was detected by wet and dry weight method. Then blood samples were taken for measurement of plasma concentration of TNF-α and IL-1β by ELISA. Results Compared with group S,the motor activitives were significantly decreased(P<0.05), brain water content were significantly increased, levels of inflammatory factors TNF-α, IL-1β were all significantly rised in group C and D1-3(P<0.05). Compared with group C, the motor activity was significantly improved in group D1(P<0.05). The levels of inflammatory factors TNF-α, IL-1βwere significantly descented in group D1-3,especially in group D1(P<0.05). Conclusion The low dose of Dexmedetomidine 0.05 μg/(kg·min) shows an neuroprotective effect against ischemic-reperfusion brain injury,the mechanism of protection may be related to inhibiting the injury of free radicals and maintaining the integrity of glial cells.

global cerebral ischemic-reperfusion; Dexmedetomidine; motor activity; TNF-α; IL-1β

徐雪，女，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師，研究方向為圍術(shù)期器官保護和應(yīng)激反應(yīng)。

河北省高層次人才資助項目(B20140051)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.07.002

R-332

A

1008-8849(2015)07-0688-04

2014-09-03