丹龍醒腦方抗缺血性腦損傷機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

曹澤標(biāo)，周小青*，張利美，陳娉婷，劉旺華

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南 長沙 410007）

丹龍醒腦方抗缺血性腦損傷機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

曹澤標(biāo)1，周小青2*，張利美1，陳娉婷1，劉旺華2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南 長沙 410007）

丹龍醒腦方；缺血性腦損傷；機(jī)制；級(jí)聯(lián)反應(yīng)；神經(jīng)再生

腦血管病是威脅中老年人健康的常見疾病，據(jù)衛(wèi)計(jì)委《2014中國衛(wèi)生和計(jì)劃生育統(tǒng)計(jì)年鑒》顯示，在2013年居民主要疾病發(fā)病率、死亡率和致殘率中，腦血管病都排前三位，給社會(huì)和家庭帶來了巨大負(fù)擔(dān)，而腦血管病中約80%屬缺血性[1]。研究表明，腦缺血后，將發(fā)生缺血性腦損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)[2]，使神經(jīng)細(xì)胞大量丟失導(dǎo)致腦功能缺失；同時(shí)處于“靜息”狀態(tài)下的神經(jīng)干細(xì)胞被激活而發(fā)生神經(jīng)再生[3]。因此，干預(yù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)減少腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞丟失和促進(jìn)神經(jīng)再生已成為治療缺血性腦血管病的主要途徑。

丹龍醒腦方是周小青教授經(jīng)驗(yàn)方，用于治療缺血性腦血管病，現(xiàn)已作為附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，并獲得了中藥新藥臨床研究批文（批件號(hào)：2003L1997）。十多年來，在臨床應(yīng)用該復(fù)方取得良好療效的同時(shí)，研究人員結(jié)合現(xiàn)代科技，對(duì)其抗缺血性腦損傷的機(jī)制進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)其能針對(duì)腦缺血后的病理生理過程進(jìn)行多方位、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)干預(yù)，現(xiàn)將有關(guān)研究成果和進(jìn)展綜述如下。

1 丹龍醒腦方與缺血性腦損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)

1.1 缺血性腦損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)

缺血性腦損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，它包括缺血期的原發(fā)性損傷和再灌注期的繼發(fā)性損傷，二者緊密聯(lián)系，呈現(xiàn)出級(jí)聯(lián)反應(yīng)。概括地說，該級(jí)聯(lián)反應(yīng)主要涉及代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、循環(huán)障礙和細(xì)胞凋亡等環(huán)節(jié)。

1.1.1 代謝紊亂 該級(jí)聯(lián)反應(yīng)的始動(dòng)因素是缺血缺氧，導(dǎo)致ATP合成減少，離子泵部分功能失效和細(xì)胞膜去極化，細(xì)胞間隙中以谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)為代表的興奮性氨基酸（EAAs）濃度升高，呈現(xiàn)出一定的毒性；同時(shí)Ca2+大量進(jìn)入胞內(nèi)出現(xiàn)鈣超載，線粒體功能障礙并損傷，一氧化氮（NO）等自由基及其代謝產(chǎn)物如丙二醛(MDA)生成增多、自由基生成抑制劑如超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，從而表現(xiàn)出一定的氧化損傷[4]。

1.1.2 炎癥反應(yīng) 氧自由基及其他信使可激活核轉(zhuǎn)錄因子尤其是核因子κB亞基(NF-κB)調(diào)控的炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[5]，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等表達(dá)增多，同時(shí)趨化因子釋放，黏附分子如細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子l等表達(dá)上調(diào)，白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞阻塞微血管，形成“無復(fù)流現(xiàn)象”，并釋放大量炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，吸引更多中性粒細(xì)胞浸潤，加重炎癥，造成惡性循環(huán)。

1.1.3 循環(huán)障礙 自由基和鈣超載可進(jìn)一步導(dǎo)致血液流變學(xué)改變，如腦血管痙攣、紅細(xì)胞變形性差、血小板聚集、纖維蛋白含量增加、血液黏稠度增加等，致使腦微小血管血栓形成；另外，NO等自由基的擴(kuò)血管作用及炎性反應(yīng)可使血腦屏障（BBB）通透性增加，甚至破壞BBB[6]。

1.1.4 細(xì)胞凋亡 腦缺血后EAAs毒性、鈣超載等各種誘導(dǎo)因素可引起細(xì)胞凋亡啟動(dòng)，然后主要通過死亡受體通路和線粒體通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為前者重要因子Fas/FasL、TNF-α、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）、凋亡蛋白酶（caspase）-8、caspase-3等表達(dá)上調(diào)；后者的重要因子細(xì)胞色素-C（Cyto-C）、第二種天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶激活物（Samc）、caspase-9、caspase-3等表達(dá)上調(diào)[7]，凋亡抑制蛋白（IAPs）尤其是X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）表達(dá)下調(diào)。細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控，腦缺血后，促凋亡基因（如Bax）及抑制凋亡基因（如Bcl-2）表達(dá)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化[8]，影響神經(jīng)細(xì)胞凋亡。需要指出的是，上述各環(huán)節(jié)常密切相關(guān)，互為因果，彼此重疊，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡和腦功能缺失。

1.2 丹龍醒腦方可多環(huán)節(jié)干預(yù)缺血性腦損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)

1.2.1 調(diào)節(jié)腦組織代謝 研究發(fā)現(xiàn)，丹龍醒腦方抗缺血性腦損傷機(jī)制與其調(diào)節(jié)腦組織代謝有關(guān)。研究者用雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)夾閉再灌注同時(shí)腹腔注射硝普鈉建立VD大鼠模型，研究該方對(duì)腦組織代謝的影響。結(jié)果顯示丹龍醒腦片組能使Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性明顯升高，腦組織中Glu、Asp、MDA、Ca2+的含量明顯降低，SOD活性顯著升高。表明該方能改善腦組織能量代謝障礙，維持細(xì)胞的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，使細(xì)胞內(nèi)外離子濃度趨向正常[9]；能調(diào)節(jié)腦組織EAAs含量、減輕其興奮性毒性，保護(hù)大腦神經(jīng)細(xì)胞[10]；還可以改善自由基代謝、減輕神經(jīng)細(xì)胞Ca2+超載[11]。另外，對(duì)腦缺血再灌注沙土鼠模型，丹龍醒腦片也能調(diào)節(jié)其腦組織EAAs含量、減輕其興奮性毒性，保護(hù)大腦海馬區(qū)神經(jīng)元[12]。

1.2.2 抑制腦內(nèi)炎癥 多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明丹龍醒腦方可通過抑制炎癥來發(fā)揮抗缺血性腦損傷的作用。在觀察活血通絡(luò)法（丹龍醒腦方）對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)再通誘導(dǎo)的中性粒白細(xì)胞浸潤的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)丹龍醒腦方能降低腦組織髓過氧化物酶（MPO）活性，減輕再灌注腦組織中性粒白細(xì)胞的浸潤[13]。研究組成員還分別就丹龍醒腦方對(duì)老齡大鼠腦缺血再灌注模型的NF-κB及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)進(jìn)行了探討[14-16]，顯示該方能顯著抑制NF-κB及ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)，表明丹龍醒腦片抗老年腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制與其抑制由缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的NF-κB及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。

1.2.3 改善大腦血液循環(huán) 研究人員觀察了丹龍醒腦片對(duì)VD模型大鼠血液流變學(xué)的改善作用，發(fā)現(xiàn)丹龍醒腦片組全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積及纖維蛋白原濃度均降低，提示丹龍醒腦片能通過改善腦缺血損傷后大鼠血液流變狀態(tài)，從而改善大腦血液供應(yīng)[17]。對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦血栓形成大鼠保護(hù)作用及對(duì)花生四烯酸(AA)代謝的影響研究表明，丹龍醒腦片組腦組織伊文思蘭吸光度值A(chǔ)620、血漿血栓素B2（TXB2）、6-酮前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)含量均明顯降低，顯示丹龍醒腦片對(duì)血栓誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的腦血栓形成具有抑制作用，對(duì)腦血栓形成后腦血管通透性的升高有抑制作用，其作用可能是通過對(duì)抗腦血栓形成而發(fā)揮的[18]。

1.2.4 減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡 大量研究證實(shí)丹龍醒腦方抗缺血性腦損傷的一個(gè)非常重要的機(jī)制是減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。研究顯示丹龍醒腦片能使MCAO大鼠模型神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）和凋亡神經(jīng)細(xì)胞積分光密度（IOD）明顯降低，海馬區(qū)存活細(xì)胞數(shù)明顯增多[19]，表明該方能減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。研究者還從介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的兩條主要信號(hào)通路進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)該方能顯著抑制Fas/FasL、TNF-α的表達(dá)，使FADD、caspase-8、caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明該組方的作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞凋亡死亡受體通路有關(guān)[20-21]。對(duì)于線粒體通路，該方能顯著減少Cyto-C、caspase-9、caspase-3、Smac并促進(jìn)XIAP的表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)元及神經(jīng)功能，提示該方作用機(jī)理與抑制細(xì)胞凋亡線粒體通路有關(guān)[22]。另外，研究人員還從細(xì)胞凋亡基因調(diào)控層面進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)丹龍醒腦方組抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)顯著性增加，凋亡基因Bax蛋白表達(dá)降低，表明丹龍醒腦方能通過增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)、抑制Bax的表達(dá)來抑制神經(jīng)元凋亡，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用[23]。

2 丹龍醒腦方與缺血性腦損傷后神經(jīng)再生

2.1 缺血性腦損傷后神經(jīng)再生

缺血性腦損傷后的神經(jīng)再生主要是指神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的增殖、遷移和分化過程。神經(jīng)干細(xì)胞終身具有分裂潛能和自我更新能力，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)[24]。研究顯示，在腦組織發(fā)生缺血缺氧等損傷后，NSCs能通過不對(duì)稱分裂增殖分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)向梗死區(qū)遷移，參與神經(jīng)功能的修復(fù)過程，即神經(jīng)發(fā)生。在此過程中，神經(jīng)干細(xì)胞所表達(dá)的特異性標(biāo)志物巢蛋白（Nestin）及星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性活化的標(biāo)志蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白 （GFAP）等表達(dá)升高[25]。同時(shí)，神經(jīng)再生還受多種調(diào)節(jié)因子和信號(hào)通路的調(diào)控。研究表明，損傷后多種促進(jìn)神經(jīng)再生的生長因子如堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF），細(xì)胞因子如睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNF）及營養(yǎng)因子如膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）的表達(dá)增加[26]，這些神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)因子在NSCs增殖、分化中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，與神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化相關(guān)的信號(hào)通路如Wnt/β-catenin[27]、Notch、骨形成蛋白、促分裂素原活化蛋白激酶、NF-κB信號(hào)通路等啟動(dòng)，從各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)NSCs的增殖、遷移和分化進(jìn)行調(diào)控。同樣，各調(diào)節(jié)因子和信號(hào)通路并非孤立的，而是交叉重疊，相互影響，共同構(gòu)成了一個(gè)影響神經(jīng)再生的精密網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。

2.2 丹龍醒腦方能促進(jìn)缺血性腦損傷后神經(jīng)再生

2.2.1 促進(jìn)NSCs的增殖和分化 研究者以5-溴脫氧尿嘧啶核苷摻入法檢測(cè)NSCs增殖，顯示丹龍醒腦方組NSCs增殖數(shù)量顯著升高，表明該方能促進(jìn)NSCs的增殖[28]。同時(shí)，研究人員還通過免疫組化法檢測(cè)Nestin，間接探討該方促NSCs增殖作用，同樣用免疫組化法檢測(cè)GFAP來探討其促NSCs分化作用，發(fā)現(xiàn)丹龍醒腦方組在治療3 d和7 d后Nestin的平均光密度增加，GFAP的平均灰度值減少，提示該方能促進(jìn)NSCs增殖和分化，其抗腦缺血損傷的機(jī)制可能與促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化有關(guān)[29]。

2.2.2 促進(jìn)多種促神經(jīng)再生調(diào)節(jié)因子的表達(dá) 研究人員通過探討丹龍醒腦方對(duì)大鼠腦缺血再灌注后NGF、bFGF和GDNF表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)較之模型組，丹龍醒腦方中、大劑量組NGF、bFGF、GDNF的陽性表達(dá)灰度值均顯著降低，即陽性率增大，提示丹龍醒腦方可能通過促進(jìn)NGF、bFGF、GDNF的表達(dá)來促進(jìn)NSCs增殖[28]。

2.2.3 通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)再生 腦缺血后神經(jīng)再生受多條信號(hào)通路的調(diào)控，有研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在NSCs的增殖分化中起重要作用，甚至處于核心地位[30]。本研究組也從Wnt/β-catenin通路探討了丹龍醒腦方促進(jìn)MCAO大鼠神經(jīng)再生的機(jī)理。近期研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，西藥組、丹龍醒腦方組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)、βcatenin、Wnt-3a蛋白及mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明丹龍醒腦方可能通過激活βcatenin及Wnt-3a蛋白表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖[31]，即與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路活化有關(guān)。

3 結(jié)語

丹龍醒腦方由丹參、三七、地龍、石菖蒲、遠(yuǎn)志、菟絲子、淫羊藿等組成，具有活血通絡(luò)、化痰開竅、補(bǔ)腎生髓之功。大量研究顯示[32-33]，對(duì)于缺血性腦損傷，活血通絡(luò)和化痰開竅法能干預(yù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，補(bǔ)腎生髓法能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化。另外，現(xiàn)代藥理研究也表明，丹參酮ⅡA能降低腦水腫，清除自由基，抑制炎癥[34]，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[35]；三七總皂苷能降低腦部細(xì)胞因子的表達(dá)和血腦屏障通透性[36]；香港遠(yuǎn)志黃酮苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠BBB有保護(hù)作用[37]；淫羊藿及其提取物對(duì)NSCs具有直接促增殖作用[38]。這些都可能是丹龍醒腦方多環(huán)節(jié)干預(yù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)和促進(jìn)神經(jīng)再生的物質(zhì)基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步研究。

然而，在取得大量實(shí)驗(yàn)研究成果的同時(shí)，還有一些尚待完善之處：（1）在多環(huán)節(jié)干預(yù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)方面已經(jīng)積累了較多成果，但對(duì)促進(jìn)神經(jīng)再生方面研究較少，而且不夠系統(tǒng)、深入，尤其是對(duì)可能的信號(hào)通路的研究，尚未見報(bào)道；（2）丹龍醒腦方干預(yù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)機(jī)制及促進(jìn)神經(jīng)再生機(jī)制分別在抗缺血性腦損傷中的作用時(shí)間窗及二者間相互關(guān)系有待研究；（3）對(duì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中各環(huán)節(jié)其他靶點(diǎn)的干預(yù)、對(duì)不利于神經(jīng)再生相關(guān)調(diào)節(jié)因子的作用及對(duì)與神經(jīng)再生相關(guān)的其他信號(hào)通路的影響尚待研究；（4）除對(duì)方中主要成分三七總皂苷進(jìn)行了抗缺血性腦損傷部分研究外，尚缺乏從本方藥理學(xué)角度探討其抗缺血性腦損傷的機(jī)制，顯然不利于該方科學(xué)性的解釋和新藥的開發(fā)；（5）目前研究多局限在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，尚未見細(xì)胞水平的研究報(bào)道。面對(duì)這些問題，研究組正在對(duì)其中一部分進(jìn)行探討，而且已經(jīng)取得了一定成果；對(duì)某些尚未著手研究的部分，期待將來?xiàng)l件成熟時(shí)逐漸解決。

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（本文編輯 匡靜之）

Experimental Research Progress on the M echanism of Danlongxingnao Fang against Ischem ic Brain Injury

CAO Zebiao1,ZHOU Xiaoqing2*,ZHANG Limei1,CHEN Pingting1,LIU Wanghua2

（1.Graduate School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China; 2.Research Institute for Diagnostics of TCM,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China）

Danlongxingnao Fang;ischemic brain damage;mechanism;cascade reaction;nerve regeneration

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.019

2014－12－24

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373702，81473567）。

曹澤標(biāo)，男，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)心腦血管疾病證治。

*周小青，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zxq5381@sohu.com。