氧化亞鐵硫桿菌固定化技術及其應用

廖澤君 史文革(南華大學核資源工程學院，湖南 衡陽 421001)

氧化亞鐵硫桿菌固定化技術及其應用

廖澤君 史文革(南華大學核資源工程學院，湖南 衡陽 421001)

氧化亞鐵硫桿菌是一種重要的浸礦細菌，細胞固定化技術能將該菌限定在特定的區域內，增加細菌密度，有效提高其對Fe2+及低價態硫的氧化能力，且能提高細菌的穩定性和機械強度，并簡化浸礦生產條件，最終提高工業生產的經濟效益。該技術運用的材料包括有機材料、無機材料和人工合成材料；涉及到的固定化方法包括吸附法、包埋法、交聯法、新固定化法等。固定化氧化亞鐵硫桿菌技術在生物浸礦和生物脫硫領域具有良好的應用前景，該技術的發展為其實現產業化奠定了基礎。

氧化亞鐵硫桿菌 浸礦 固定化 載體 脫硫

然而，游離態的A.f菌的密度和氧化活性均較低，增殖速度和對Fe2+、S、S2-的氧化速率也較緩慢；較低的反應穩定性和機械強度使得其對生物反應器的性能要求較高；循環利用困難；自身代謝周期長等限制了其工業應用[8]。針對這些難題，各國科研工作者做了大量研究，由此A.f菌的細胞固定化技術得到了較廣泛探究。

1 細胞固定化技術

細胞固定化是用特定的方法將游離狀態的細胞限定在特定的區域內，并保持該微生物原有的各種特性，且有利于該微生物重復利用的技術[9]。20世紀60年代開始固定化酶的研究，到20世紀70年代逐漸應用到細胞的固定化研究。目前，細胞固定化已是一項在工業上得到廣泛應用的重要技術。

與將游離微生物用于工業生產相比，固定化微生物有以下特點[10]：①密度增加，從而增加反應速率、提高生產能力；②穩定性、機械強度明顯提高；③有更高的酶穩定性，有利于反應連續化；④提高次生產物的合成和積累，進一步提高產品生產效率；⑤可在高稀釋率的情況下進行操作，而不產生流失現象；⑥能長時間保持細胞活力，并反復利用；⑦能簡化設備，優化工藝流程，生產條件更加簡單，產品易分離，降低成本[11]。

1.1 細胞固定化方法[12]

1.1.1 吸附法

吸附法包括物理吸附法和離子吸附法[13-14]。利用吸附載體與細胞之間的相互作用力，使細胞吸附在載體表面和內部形成生物膜。這種方法操作簡便，條件溫和，活性損失小，載體成本低，但是細胞與載體之間作用力小，當外部環境變化較大時細菌容易脫落[15]。常用載體有活性炭、木屑、聚氨酯泡沫、金屬絲網、硅膠、離子交換樹脂、硅藻土、多孔玻璃、陶瓷、中空纖維等[16]。

1.1.2 包埋法

包埋法[17]是將細胞包在不溶于水的凝膠或者半透膜聚合物的超濾膜內，在保證細胞不泄露的前提下，便于溶液進入、產物排出的細胞固定法。使用前一種材料叫凝膠包埋法，使用后一種材料半透膜包埋法[18]。該方法簡單、條件溫和、穩定性好、細胞容量高，并可以根據不同的應用將固定化的微生物制成各種形狀，是應用最廣的細胞固定化方法[19]。其固定化載體材料主要有卡拉膠和海藻酸鈉，其次是瓊脂、明膠、聚丙烯酰胺、海藻酸鈣、角叉菜聚糖等。

1.1.3 共價結合法

共價結合法是通過共價交聯將細胞與載體表面的基團形成共價鍵而固定生物細胞的方法[16]，通常將細胞直接連接到已活化的有機載體或者無機載體上。細胞與載體之間的結合能力強，固定細胞在使用過程中不易脫落，但是其反應條件苛刻，細胞易失活甚至死亡，且可操控性難[20]。常用的載體有硅膠、陶瓷、瓊脂糖珠等。

1.1.4 交聯法

交聯法[21]分為物理交聯法和化學交聯法，不需要載體，是用特殊的交聯試劑，通過物理或化學作用使細胞表面的反應基團相互交聯成網狀結構，從而固定細胞體的方法。常用的交聯劑有醛類(如戊二醛)、胺類(如雙重氮聯苯胺)、水合金屬氧化物、甲苯二異氰酸、甲苯二異氰酸酯等。該方法使細胞之間空隙較小，但相當數量的交聯劑有毒性，致使細胞失活率較大，通常與包埋法結合起來使用。

1.1.5 新固定化法

新固定化法[22]是針對不同的工業生產要求而發展起來的一些新方法，包括超微載體法、復合固定法和膜固定法。超微載體法的固定化基質尺寸僅有幾百納米，沒有空隙也就不會發生內擴散，且固定化微生物的活性高；復合固定法[23]主要有吸附-包埋法、包埋-交聯法、吸附-包埋-交聯法等，將2種或2種以上的傳統固定法結合起來，能克服傳統單一固定化法所存在的缺點，且能提高固定化微生物的生物性能[24]；膜固定法應用較多，能很大程度上提高工藝中傳質能力，但是膜不穩定，不利于循環使用。

1.2 固定化載體

固定化載體材料的選擇與制備是A.f菌固定化技術的關鍵。符合工業生產要求的理想固定化載體應有以下特性[25]：①對微生物無毒副作用，不影響細胞活性；②滲透性較好，不影響微生物代謝速度；③機械強度好，能保持微生物穩定性；④能長時間循環使用，不被溶解，且固液分離簡單；⑤固定化工藝簡單，經濟成本低[26]。固定化載體分為有機材料、無機材料和人工合成材料。

1.2.1 有機材料

可用作固定化載體的有機材料有膠原蛋白、淀粉、甲殼素、醋酸纖維素、海藻酸鈉凝膠、海藻酸鈣凝膠、瓊脂、明膠、卡拉膠、角叉菜膠、纖維素、殼聚糖等。這類材料對細胞無毒，傳質性能佳，固定化操作簡單，且可以制成各種形狀大小[27]。但是有些材料強度低、且有可能被細胞或溶質溶解。其中，最常用的材料海藻酸鈉與交聯劑生成的海藻酸鹽很容易被溶解，因此海藻酸鈉通常和其他一些材料(如殼聚糖、聚乙烯醇等)制成復合材料來固定化A.f菌[28]。

張爽等[29]采用海藻酸鈉固定化包埋A.f菌，制備海藻酸鈉-氯化鈣固定化凝膠小球。試驗通過測定Fe2+的氧化率，并分組篩選海藻酸鈉、氯化鈣及細胞的濃度，得出A.f菌固定化凝膠小球的最佳制備條件是：海藻酸鈉溶液的濃度為 0.025 g/mL、細胞濃度為1.2×107cell/mL；交聯劑中氯化鈣的濃度為0.02 g/mL。固定化操作過程簡易，小球直徑均勻，機械強度高，不黏連，穩定性好，有很好的應用價值。

1.2.2 無機材料

可用作固定化載體的無機材料有沸石、陶瓷、煤矸石、高嶺土、活性炭、氧化鋁等[30]。這些無機材料多數具有很多空隙，能通過吸附作用和靜電力將與其接觸的細胞固定在材料上。固定化工藝過程較為簡單，細胞容量較高，而且載體可以循環利用，但是細胞結合時間短，在流動性反應器中固定化易被破壞[27]。

李志章等[31]以沸石為填料固定化A.f菌，在空氣量為0.5 m3/h、循環液體流量為1.0 L/h、培養基初始pH=2.0、Fe2+初始濃度為8 g/L左右的條件下，固定化細胞只需10 h就能使Fe2+的氧化率達到95% 以上，其對Fe2+的平均氧化速率高達0.88 g/(L·h)；而游離細胞對Fe2+的平均氧化速率僅為0.08 g/(L·h)。黃亞潔等[32]選擇木屑和圓柱狀活性炭固定A.f菌，并制作固定床生物反應器。結果表明，固定床反應器容積為0.65 L，木屑尺寸為12 mm×5 mm×1 mm，在通氣速率為1.4 L/min、稀釋率為1.1 h-1時，Fe2+的最大平均氧化速率為5.83 g/(L·h)。

1.2.3 人工合成材料

由于單一的有機材料或無機材料有不可避免的缺點，人工合成材料成為科研工作者研究的主要方向，這類材料主要包括人工高分子材料(如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚氯乙烯、聚氨基酸、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇等)和由多種材料結合而成的復合材料(如海藻酸鈉-二氧化硅復合水凝膠、海藻酸鈉-聚乙烯醇混合水溶膠、海藻酸鈉-聚丙烯酰胺等)。這些材料發揮每種組合材料的優點，形成優勢互補，在細胞固定化技術領域前景良好。

張赫[33]用海藻酸鈉-聚乙烯醇復合水溶膠混合A.f菌，用硼酸為凝固劑制成固定化顆粒，在搖瓶中pH=1.8時，固定化顆粒對Fe2+的氧化速率最快，固定化顆粒的穩定性良好；固定化小球在生物反應器中稀釋率為0.6 h-1、通氣量為700 mL/min時Fe2+氧化速率最高為2.912 g/(L·h)，平衡時Fe2+氧化速率為1.236 g/(L·h)，反應器中鐵礬沉淀較少。

2 氧化亞鐵硫桿菌固定化技術的應用

2.1 氧化亞鐵硫桿菌固定化技術在浸礦領域的應用

A.f菌是最主要的浸礦微生物，主要是利用其獨特的氧化能力所生產的Fe3+和H2SO4將礦物氧化成可溶的硫酸鹽[34]。Fe3+氧化礦物被還原成Fe2+，Fe2+又被A.f菌氧化成Fe3+再繼續氧化礦物，這樣構成一個氧化還原的浸礦循環。該菌可應用于低品位銅、鈾、金、鋅、鈷等金屬礦的浸出生產[35]。將A.f菌固定化，生產Fe3+用于化學浸出，可以提高浸礦效率，縮短浸礦周期，節約浸礦成本、提高經濟效益。

陶敏慧[36]利用聚氨酯泡沫為載體固定A.f菌和西伯利亞硫桿菌生產Fe3+，用以浸出難浸高砷金礦。試驗結果表明，利用聚氨酯泡沫固定化技術可大幅度提高細菌對Fe2+的氧化速率，在溫度為50 ℃，通氣量為4 L/min的條件下，固定化微生物在5 h內對濃度為10 g/L的Fe2+的氧化率為95%，約是相同條件下，接種量為10%的該游離菌搖瓶試驗反應時間的1/7；酸性硫酸鐵溶液浸出高砷金礦的速率優于游離細菌的直接浸礦體系，70 ℃、10 g/L的酸性硫酸鐵溶液連續浸出高砷金礦，4 d內砷的浸出率達到71%；高砷金礦采用固定化微生物浸出工藝處理效果更好。

王銀梅[37]選用有機塑料瓶蓋為填料載體，通過吸附法將A.f菌與氧化硫硫桿菌的混合菌固定化，在自制的生物反應器中進行硫化銅礦生物浸出試驗，固定化混合菌18 d時的銅浸出率達45.23%，對應的最佳浸礦系統參數為礦漿濃度10%、細菌接種量10%、浸礦pH=2、礦石粒度為-75 μm。

2.2 氧化亞鐵硫桿菌固定化技術在脫硫領域的應用

用固定化A.f菌的產物Fe3+間接氧化并脫除SO2和H2S，不僅脫除率高、不產生污染物，而且投入成本低，有利于我國環境的保護，符合可持續發展的國策。

劉曉偉[38]用活性炭為載體固定化A.f菌，并制作滴濾塔處理SO2廢氣，在溫度為 25～30 ℃時，進氣口SO2質量濃度小于1 740 mg/m3，氣體在反應器中停留時間為 80 s 左右，循環營養液中Fe2+濃度高于2.6 g/L，循環營養液流量0.9 L/h 左右的條件下，SO2去除率達到 90% 以上。

蘇峰[39]采用新型固定化載體通過吸附法固定A.f菌，并制作生物-化學反應器進行脫H2S研究，在通氣量為125 L/h、稀釋率為0.43 h-1條件下，固定化系統的氧化速率最高，達3.205 g/(L·h)；當Fe3+濃度為8 ～ 12 g/L、氣速為40 ～ 60 mL/min時能達到最佳的脫硫效果。

3 結論與展望

(1)從A.f菌被發現到其固定化技術的發展，國內外科研工作者做了大量研究。固定化A.f菌作為生產Fe3+的主要微生物氧化劑，由于A.f菌固定化技術簡單、細菌可重復利用以及生產成本低等優點，因此固定化A.f菌在環境治理、微生物浸礦等領域展現了良好的發展前景。

(2)A.f菌固定化技術目前尚不成熟，多數工作還處在室內試驗或半工業試驗探索階段。載體的無毒性、優良的滲透性及機械強度、小成本、高循環利用率及其簡單固定化工藝等方面還需要做更多更深入的探究，這是決定這項技術在未來發展的首要問題。隨著針對這些問題的生物學、材料學研究的深入，A.f菌固定化技術會完全實現工業生產。

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(責任編輯 羅主平)

Immobilized Technology of Acidithiobacillus Ferrooxidans and Its Application

Liao Zejun Shi Wenge(CollegeofNuclearResourcesEngineering,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China)

Acidithiobacillusferrooxidansis an important bacteria for ore-leaching.Cell immobi-lized technology can limit the bacteria within a particular region,increase the density of bacteria,effectively increase the oxidability on Fe2+and low-valent sulfur,improve the stability and me-chanical intensity,simplify the conditions of production,and ultimately improve the economic benefits of industrial production.Materials used by this technique include the organic materials,inorganic materials and artificial synthetic materials.Immobilized methods involved include adsorption method,embedding cross methods,cross-linking methods,new immobilization methods,et al.The immobilized technology has a good application prospect in the field of bioleaching and bio-desulfurization,development of which establishes the foundation for realizing its industri-alization.

Acidithiobacillusferrooxidans,Ore-leaching,Immobilization,Carrier,Desulfurization

2014-10-22

廖澤君(1990—)，男，碩士研究生。通訊作者 史文革(1967—)，男，教授。

TD925.5

A

1001-1250(2015)-01-062-05