豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗SH 株免疫仔豬的田間效力評估試驗(yàn)

杜根成，左 松，馬 坤，胡群山，虞德屏，郭小參，徐祥臣，阮坤祥，張立昌

（普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000）

豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（PCVD）引起仔豬高死亡率、低效生產(chǎn)率，是近10 年來嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，其臨床表現(xiàn)以斷奶仔豬多系統(tǒng)消耗綜合征（PMWS）為主[1-3]。該傳染病主要侵害6～8 周齡仔豬,引起仔豬淋巴系統(tǒng)疾病[4-5]、漸進(jìn)性體重下降、呼吸道癥狀及黃疸,造成患豬免疫機(jī)能下降、生產(chǎn)性能降低[6]。目前，部分豬場已經(jīng)通過加強(qiáng)飼養(yǎng)管理與藥物控制等方案進(jìn)行綜合預(yù)防和控制，雖然取得一些效果，但是尚不能完全控制該病的流行。近年來多家疫苗生產(chǎn)企業(yè)相繼研發(fā)并生產(chǎn)出豬圓環(huán)病毒疫苗，為有效控制該病帶來新的手段[7-8]。但不同公司產(chǎn)品使用方案不盡相同，為了有效評估使用的豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗對豬場的作用，開展以下的試驗(yàn)工作。

1 材料與方法

1.1 材料 豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗（批號：120317，購自普萊柯生物工程股份有限公司）；試驗(yàn)豬場及試驗(yàn)用哺乳仔豬，上海某豬場；豬圓環(huán)病毒2 型抗體檢測試劑盒（批號：120501，購自天津瑞普生物藥品有限公司）；PCR 診斷試劑盒（批號：0831，購自上海天根生物科技有限公司）；PCR檢測儀，購自東勝儀器公司；東勝龍黑金剛型號EDC-810-5；超速離心機(jī)，美國熱電公司micro17；電泳儀電泳漕，JY-SP3，JY200C；成像系統(tǒng)，上海領(lǐng)成Tocan320；酶標(biāo)儀MK3 型，美國熱電公司。

1.2 方法

1.2.1 隨機(jī)挑選16 頭即將于1 周內(nèi)生產(chǎn)的懷孕母豬，并分為（A和B2 組），每組8 頭。母豬分娩后，所有A組母豬所產(chǎn)的仔豬于14 日齡免疫豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗，肌肉注射1 mL/頭；35 日齡加強(qiáng)注射1 次，肌肉注射1 mL/頭；B組母豬所產(chǎn)仔豬為對照組，不免疫豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗。

1.2.2 試驗(yàn)?zāi)肛i分娩時統(tǒng)計(jì)產(chǎn)子數(shù)、產(chǎn)子窩重、仔豬初生重、活仔數(shù)；斷奶后，統(tǒng)計(jì)免疫組及對照組3 周齡、4 周齡、6 周齡、8 周齡的存活率。

1.2.3 體溫檢測 在免疫豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗前、免疫后1、2、3、4 d，隨機(jī)對免疫組和對照組的各15 頭仔豬進(jìn)行體溫檢測，并記錄體溫，同時觀察豬群是否出現(xiàn)臨床副反應(yīng)如精神狀態(tài)不佳、拉稀、采食下降、神經(jīng)癥狀等。

1.2.4 稱重 統(tǒng)計(jì)增重情況，試驗(yàn)豬分別在出生當(dāng)天、1、2、3、4、6、7、8 周齡進(jìn)行稱重，并分析仔豬的增重情況，統(tǒng)計(jì)分析體重均一度（離散度）。

1.2.5 抗體檢測 在A組、B組中各選擇15 頭仔豬分別在免疫前（2 周齡）、免疫后1 周（3 周齡）、二免后1 周（6 周齡）、2 周（7 周齡）采血，ELISA方法檢測PCV-2 的抗體。

1.2.6 PCR 方法檢測病毒血癥 上游引物PCV2F 1096：5′-GGATATTGTAG（T）TCCTGGTCG-3′，下游引 物PCV2R1588：5′-TCCCG-CACCTTCGGATATAC-3′。引物所在區(qū)域?yàn)镻CV-2 高度保守的衣殼蛋白編碼區(qū)。擴(kuò)增的目的片段大小分別為493 bp。反應(yīng)體系：PCF1096（10 μmol/L/μL）0.5 μL，PCF1588（10 μmol/L/μL）0.5 μL，2×Mixture12.5 μL，dd H2O8.5 μL，DNA模板3 μL，總體系25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40循環(huán)后，72 ℃溫育10 min。25 μL PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上90 V條件下，電泳40 min，凝膠成像儀下觀看并成像。

2 結(jié)果

2.1 統(tǒng)計(jì)仔豬存活率 比較免疫組和對照組的仔豬存活率，仔豬3 周斷奶時的免疫組存活率為91.8%,高于對照組的78.57%。4 周齡免疫組存活率為98.65%，也高于對照組存活率90.91%；因此，仔豬免疫豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗能有效提高仔豬存活率，結(jié)果見表1。

表1 3周齡和4周齡免疫組與對照組成活率統(tǒng)計(jì)

2.2 斷奶增重統(tǒng)計(jì) 經(jīng)過對A組、B組斷奶重于初生重的比較和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，免疫組平均增重為0.2241 kg/頭·d；對照組只有0.2052 kg/頭·d。免疫組要比對照組多增重0.0189 kg/頭·d。因此，在仔豬階段免疫可以提高仔豬的日增重（ADG），見表2。

2.3 仔豬斷奶后，分別于21、28、42、56 日齡稱重，經(jīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，保育舍日增重免疫組略優(yōu)于對照組，而且免疫豬群在21、28、42、56 日齡的離散度分別是0.11、0.09、0.09、0.15 均低于對照組的0.14、0.12、0.15、0.34，說明豬群免疫后生長的均一度也好于對照組，結(jié)果見表3。

表2 斷奶日增重統(tǒng)計(jì)比較

表3 免疫組與對照組在保育階段平均體重統(tǒng)計(jì)表

2.4 體溫測量及臨床觀察 免疫前后對仔豬進(jìn)行體溫檢測和臨床觀察，結(jié)果表明，免疫組在疫苗免疫后1 d 有體溫升高平均體溫升至39.84 ℃，高于對照組，體溫在第2 天后逐步恢復(fù)正常。結(jié)果見圖1。免疫組仔豬，在免疫后1 d 出現(xiàn)1 頭仔豬精神沉郁，采食減少，第2 天，采食量回復(fù)，第3天恢復(fù)正常，其他的仔豬都表現(xiàn)正常，免疫2 d 后所有免疫組仔豬均恢復(fù)正常。對照組只在第1 天有1 頭豬出現(xiàn)精神沉郁。

2.5 抗體水平 免疫仔豬后，經(jīng)ELISA試驗(yàn)檢測PCV-2 的抗體水平，試驗(yàn)結(jié)果表明，豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫后免疫組A組抗體水平轉(zhuǎn)陽率比對照組要高、轉(zhuǎn)陽時間比對照組要早，而且第二次加強(qiáng)免疫后抗體轉(zhuǎn)陽率更高，在49 d 全部轉(zhuǎn)陽，詳細(xì)結(jié)果見表4；S/P 值的數(shù)據(jù)分析表明，免疫組的抗體水平也要高于對照組，而且離散度在42 d 和49 d 時小于對照組，結(jié)果見表5。

圖1 免疫前后平均體溫變化

2.6 PCR 檢測病毒血癥 分別對免疫前后仔豬采血，PCR 檢測仔豬病毒血癥。檢測結(jié)果表明，免疫1 次PCV-2 疫苗后仔豬群病毒血癥陽性率會明顯下降，隨后與對照組一樣，逐步回升，但是，相同日齡的病毒血癥陽性率明顯低于對照組，結(jié)果見表6。

表4 免疫后PCV-2抗體陽性率變化

表5 免疫后ELISA檢測抗體水平S/P平均值及離散度變化

表6 PCR檢測病毒血癥陽性率變化

3 討論

3.1 本次田間試驗(yàn)，通過檢測仔豬圓環(huán)病毒2 型的ELISA抗體，發(fā)現(xiàn)免疫仔豬初期抗體水平較低，后期隨日齡增大而抗體水平升高，這可能與母源抗體不高，豬場存在野毒感染有關(guān)。本次試驗(yàn)，懷孕母豬沒有免疫豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗，所以，母源抗體不會很高也不整齊。此外，在做試驗(yàn)期間正處于8月份，天氣炎熱，與母豬奶水不足也有一定關(guān)系。其次，仔豬抗體水平隨日齡增長而升高，免疫組抗體水平的增加與免疫的豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗直接相關(guān)，尤其是在加強(qiáng)免疫后，抗體轉(zhuǎn)陽率高于對照組。這說明，免疫豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗起到一定作用。對照組仔豬抗體水平的增加，可能PCV-2 野毒感染有關(guān)。對照組經(jīng)過自然感染，抗體水平逐步提高，至保育后期，抗體水平和免疫組相當(dāng)。這也提醒我們，僅僅依靠檢測PCV-2 抗體水平對疫苗質(zhì)量進(jìn)行評估是不夠的。

3.2 免疫后，免疫組仔豬體溫出現(xiàn)升高現(xiàn)象，這可能與疫苗產(chǎn)生免疫刺激有關(guān)。本試驗(yàn)采用的疫苗佐劑為水包油包水類型，免疫刺激相對要強(qiáng)些，但是，體溫在免疫后2 d 便自行恢復(fù)。體溫升高會造成極少數(shù)的仔豬出現(xiàn)精神沉郁，這種情況也會在2 d 后自行恢復(fù)。

3.3 從PCR 檢測仔豬病毒血癥的結(jié)果來看，免疫后病毒血癥明顯下降，說明接種豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗可以降低仔豬病毒血癥，但是，隨仔豬生長，對照組仔豬發(fā)生病毒血癥的比例會逐漸升高，同時，免疫組病毒血癥也有所增加，只是免疫組的病毒血癥發(fā)生比例低于對照組。這說明，免疫疫苗對控制豬圓環(huán)病毒血癥有一定幫助；此外，免疫過豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗的豬群仍可感染PCV-2，而且，隨著免疫時間增長，感染比例也會增加，這與有關(guān)文獻(xiàn)報道是一致的。

3.4 從仔豬哺乳階段的存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，免疫豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗有助于提高仔豬的生長，尤其是存活率、日增重等指標(biāo)，例如斷奶日增重統(tǒng)計(jì)中，免疫組高于對照組18.9 g/d。

3.5 保育豬的增重統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，對照組與免疫組差異不明顯，這與生產(chǎn)（試驗(yàn)）過程中，對照組已經(jīng)淘汰掉了生長不良仔豬，只統(tǒng)計(jì)可生長良好的仔豬有關(guān)；盡管如此，免疫組的各日齡體重的離散度仍然小于對照組體重的離散度，這說明免疫組豬群生長的均一度好于對照組。

3.6 本次試驗(yàn)出現(xiàn)病毒血癥陽性比率與ELISA抗體陽性率同步增長現(xiàn)象，可能與本試驗(yàn)過程中所測到的ELISA抗體并非中和抗體有關(guān)。

總體而言，在PCV-2 感染豬場，尤其是已經(jīng)表現(xiàn)出PCV-2 相關(guān)疾病，如PMWS等臨床癥狀的豬群，仔豬免疫豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗有助于降低病毒血癥、提高仔豬存活率，促進(jìn)仔豬生長。

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