榮昌部分地區(qū)鴨源致病性大腸桿菌的分離及血清型鑒定

伍 莉，陳鵬飛

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460；2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)水產(chǎn)系，重慶 榮昌 402460）

鴨大腸桿菌病由致病性大腸桿菌引起。該病可侵害各種日齡的鴨，易感日齡為2～6 周齡，發(fā)病率為25%～40%，死亡率可達(dá)10%～30%。呼吸道、生殖道感染和種蛋污染是該病主要的傳播途徑。鴨大腸桿菌病常與其他病混合發(fā)生，導(dǎo)致死亡率上升，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于大腸桿菌的血清型較多，抗原復(fù)雜，臨床表現(xiàn)具有多樣性，給該病的防治帶來極大困難。本試驗(yàn)對榮昌縣部分地區(qū)鴨大腸桿菌病的血清型進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料 2011 年12 月至2012 年12 月采自榮昌縣8 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)96 只大腸桿菌病鴨的肝臟。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明系小鼠104 只，雌雄不限，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 試劑 各種培養(yǎng)基由西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系提供；腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管由杭州天和微生物試劑有限公司提供（批號(hào)：120123）；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗O因子血清由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供（批號(hào)：120324）。

1.4 細(xì)菌分離鑒定 將病料分別接種于普通營養(yǎng)平板、麥康凱平板，置37 ℃培養(yǎng)24 h，涂片，革蘭染色鏡檢。挑取培養(yǎng)基上的單個(gè)典型菌落，依次接種于麥康凱平板、肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.5 生化試驗(yàn) 取純培養(yǎng)菌落接種肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，按常規(guī)方法進(jìn)行生化試驗(yàn)15 項(xiàng)[1]。

1.6 血清型鑒定 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗O因子血清凝集試驗(yàn)，按照使用說明書和文獻(xiàn)操作[2-3]。

1.7 致病性試驗(yàn) 取定型后的大腸桿菌分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，4 000 r/min 離心20 min，用滅菌生理鹽水配成含菌量為20 億/mL 懸浮液作攻毒用[4]。將104 只小鼠，隨機(jī)分為13 組，每組8 只；前12 組為試驗(yàn)組，腹腔注射0.2 mL 懸浮液，第13 組為空白對照組，腹腔注射0.2 mL 生理鹽水。接毒后記錄小鼠發(fā)病與死亡情況，未死亡小鼠接毒后第10 天撲殺，剖檢死亡小鼠，取肝臟抹片，革蘭染色鏡檢[5]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 共分離到77 株大腸桿菌，在麥康凱平板上形成紅色菌落；在營養(yǎng)瓊脂上形成圓形凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落；在普通肉湯營養(yǎng)培養(yǎng)基中變渾濁，管底有黏性沉淀，液面管壁有菌環(huán)。鏡檢發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌呈紅色（革蘭染色陰性），形態(tài)為兩端鈍圓的短桿狀，多數(shù)為單個(gè)散在，少數(shù)為成對連接。由此初步鑒定這77 株細(xì)菌為大腸桿菌。

2.2 生化試驗(yàn) 分離到的細(xì)菌不產(chǎn)生硫化氫，不能利用苯丙氨酸、枸櫞酸鹽和葡萄糖酸鹽，不分解尿素，不能液化明膠；能分解葡萄糖和山梨醇，45 株可分解棉子糖，73 株菌株可分解木糖，73 株可與木糖反應(yīng)，69 株可與賴氨酸反應(yīng)，61 株可與鳥氨酸反應(yīng)；甲基紅試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)均呈陽性；V-P 試驗(yàn)均呈陰性（表1）。

2.3 血清型鑒定 77 株大腸桿菌分屬于12 種血清型，其中以O(shè)76、O78、O92、O142為優(yōu)勢血清型，分別占總分離菌株的16.8 % 、24.7 % 、23.4 % 和19.5 %（表2）。

2.4 致病性試驗(yàn) 接毒后10 h 試驗(yàn)組小鼠開始出現(xiàn)死亡，其中以O(shè)45、O92、O93和O142的致病性最強(qiáng)，致死率達(dá)到100 %。剖檢死亡小鼠可見肝臟嚴(yán)重出血或呈暗紅色，脾和腎表面有出血點(diǎn)，腸黏膜有出血、水腫現(xiàn)象，腸內(nèi)容物稀薄有氣泡。從死亡小鼠肝臟中均能分離到大腸桿菌。

表1 大腸桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果

表2 大腸桿菌O抗原血清型鑒定結(jié)果

對照組小鼠全部存活（表3）。

3 討論

3.1 小鼠致病性試驗(yàn)顯示，12 種血清型的大腸桿菌均有不同程度的致病性，其中以O(shè)45、O92、O93和O142的致病性最強(qiáng)，致死率達(dá)到100 %；O2的致死率最低，只有20 %。

表3 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

3.2 分離到的77 株大腸桿菌分屬于12 種血清型，以O(shè)76、O78、O92、O142為優(yōu)勢血清型，這與央珍[6]的報(bào)道一致，但是本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的O2、O9為國內(nèi)不常見的血清型。這一結(jié)果表明，本地區(qū)流行的鴨大腸桿菌病血清型復(fù)雜，在防治本病選擇疫苗時(shí)應(yīng)與本地流行血清型相對應(yīng)；有條件的鴨場應(yīng)進(jìn)行血清型診斷，采用本地（場）菌株制造滅活疫苗進(jìn)行預(yù)防接種。

3.3 鴨大腸桿菌可侵害各種日齡的鴨，其中以2～6 周齡的雛鴨和中鴨最易感染，發(fā)病率最高[7-8]，日齡越小的雛鴨感染鴨大腸桿菌死亡率越高。在發(fā)生大腸桿菌病后，一般鴨場都選擇使用抗生素來治療，但由于用藥單一，缺乏合理性，藥量無度，沒有明顯的周期性；還由于飼養(yǎng)人員素質(zhì)較低，沒有專業(yè)的畜牧獸醫(yī)知識(shí)，防疫意識(shí)淺薄，不能提前落實(shí)防疫工作，只是等到發(fā)病后盲目的濫用抗生素治療，既起不到治療的效果還增加了大腸桿菌的耐藥性；以上綜合因素導(dǎo)致大腸桿菌病的治療效果不明顯[11]。

4 結(jié)論

分離到的77 株鴨大腸桿菌對小鼠均有致病性，其優(yōu)勢血清型為O76、O78、O92、O142；有條件的養(yǎng)殖場應(yīng)進(jìn)行血清型診斷，采用本地（場）菌株制造滅活疫苗進(jìn)行預(yù)防接種。

[1]沙莎，宋振輝主編.動(dòng)物微生物實(shí)驗(yàn)教程[M].重慶：西南師范大學(xué)出版社，2011：16-43.

[2]于學(xué)輝，程安春，汪銘書，等.鴨致病性大腸桿菌的血清型鑒定及相關(guān)獨(dú)立基因分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（1）：12-13.

[3]宋立，寧宜寶，張廣川，等.我國華東地區(qū)大腸桿菌、沙門氏菌分離和血清學(xué)鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，26（2）：142-145.

[4]劉吉山，沈志強(qiáng)，王燕，等.我國部分地區(qū)禽致病性大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].中國家禽，2005，27（7）：14-16.

[5]雷連成，鄭丹，韓文瑜，等.動(dòng)物源性大腸桿菌藥物敏感性檢測及耐藥性分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，25（5）：470-473.

[6]央珍，聶奎.重慶市部分地區(qū)鴨源大腸桿菌的O抗原血清型及耐藥性[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，33（8）：52-56.

[7]蔡寶樣.家禽傳染病學(xué)[M].3 版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：5-55.

[8]劉廣忠，李甲印，趙貴峰 等.鴨大腸桿菌病的病原特點(diǎn)及綜合防治[J].水禽世界，2009（5）：40-41.