藥用植物青陽參可培養內生菌分離與多樣性分析

路則寶

(楚雄醫藥高等專科學校，云南楚雄675005)

內生菌可生活在各種植物的根、葉、莖、花與果實內，主要包括細菌、真菌、放線菌，其類群十分豐富，能夠產生很多新的活性物質，因此植物內生菌已成為國內外生物學和化學領域的研究熱點。內生菌對于宿主植物主要有益的作用有調節生長、抗蟲害、抗逆性及促進植物體內次生代謝產物的合成等。內生菌可以通過促進中藥有效成分的生成或積累影響道地藥材的形成與品質。隨著植物內生菌研究的不斷深入發展，多種有藥用價值的菌株、代謝產物不斷被發現。Rubalcava等［1］從馬鞭草(Callicarpa acuminata)內生真菌Edenia gomezpompae中分離到具有化感素活性及抗真菌活性的萘醌(spiroketal)物質。Rukachaisirikul等［2］報道，一種具有抗結核和抗真菌的活性化合物phomoenamide是由內生真菌Phomopsis sp所產生的。因此，植物內生菌在農業、工業、醫藥衛生等領域有巨大的應用潛力。

藥用植物作為一類新的內生菌來源正成為內生菌研究者廣泛研究的對象。藥用植物內生真菌的研究對于開發利用藥用植物及藥用植物資源的保護有著非常重要的經濟效益和生態效益。青陽參(Cynanchum otophyllum Schneid)是蘿摩科鵝絨藤屬(Cynanchum Linn．)植物，屬多年生草本纏繞植物，根莖入藥，一直在云南民間流傳沿用，主產于云南中部、西北部和東北部地區。以青陽參為原料，現已開發出云南特色多種中成藥。有許多學者已對青陽參的化學成分，藥理毒理活性、含量測定，生藥學，繁殖技術和遺傳多樣性等進行了深入研究［2－5］。但是，對于青陽參植物內生菌的研究報道至今未見。筆者就青陽參植物內生菌進行分離和分類鑒定，以期為青陽參資源的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1．1供試植物樣品 植物樣品青陽參采自云南省楚雄市西山，海拔高度1 800 m。

1．2 培養基 細菌的分離培養用牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 20 g，水 1 000 ml，pH自然，加入兩性霉素B以抑制真菌生長)。

真菌分離培養用PDA固體培養基(加入青霉素、鏈霉素以抑制細菌生長)，真菌鑒定用PDA固體培養基、促孢固體培養基(KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0．5 g、KNO31 g、KCl 0．5 g、淀粉 0．2 g、蔗糖 0．2 g、葡萄糖 0．2 g、瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 ml，pH 自然)。

1．3 內生菌的分離、純化和培養 采集健康、新鮮的葉、莖和根組織樣品，沖洗干凈，并且吹干表面水分。取適量無菌水、75%乙醇、0．1%升汞，分別放入預先滅菌的燒杯中，將植物葉、莖和根剪成長段，備用。樣品先于75%乙醇中浸泡消毒，然后于0．1%升汞中浸泡消毒，將消毒完畢的樣品在無菌水中連續清洗后晾干，剪成小塊，用無菌的解剖刀從中間切開，使得植物內部盡量暴露。將剪好的小塊分別接種到牛肉膏蛋白胨培養基和PDA固體培養基平皿表面，同時用清洗消毒樣品的無菌水涂布為對照，分別于37和28℃培養，挑取植物組織周圍的菌落，對所分離的內生菌進行純化，并且根據菌落形態特征和個體形態特征進行歸類培養［6］。

1．4 內生菌的分類鑒定 內生細菌的鑒定參照文獻［7－8］，同時依據菌落形態觀察、革蘭氏染色形態、莢膜和芽孢有無、動力學試驗、生理生化特征等進行研究。

真菌鑒定采用平板插片法，將菌種接種于固體PDA和促孢固體培養基上，28℃培養，菌落長出時斜插滅菌蓋玻片，培養后用鑷子取下蓋玻片在光學顯微鏡下觀察顯微形態特征，鑒定到屬(分類檢索參照文獻［9－11］)。

2 結果與分析

2．1 不同部位分離出內生菌的數量分布 內生菌在不同組織中種群、數量分布有差異，共分離出內生菌56株，真菌34株，細菌22株;根中分離28株，莖中9株，葉中19株。在根、莖、葉中分別分離出細菌12、3、7株，分別分離出真菌18、4、12株。總的內生菌分離結果為根部最多，莖中最少。

有些種屬在各個組織中均有分布，有些則表現出一定的組織專一性。葉中優勢細菌種群為芽孢桿菌屬和泛菌屬，根中為土壤桿菌屬、假單胞桿菌屬和腸桿菌屬。葉中優勢真菌種群為交鏈孢屬，根中優勢種群為腐霉屬。

2．2 內生菌種群組成多樣性 通過菌落形態、染色鏡檢等，初步鑒定22株內生細菌屬于6個屬，包括土壤桿菌屬(Agrobacterium sp．)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp．)、泛菌屬(Pantoea sp．)、腸桿菌屬(Enterobacter sp．)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)，表明青陽參內生細菌具有生物多樣性。

從植物根、莖和葉中，共分離獲得34株內生真菌，其中25株內生真菌經形態學顯微觀察鑒定為12屬(表1)，說明青陽參植物內生真菌種類繁多，微生物資源豐富。在科一級分類水平上，以叢梗孢科和暗梗孢科為優勢類群;在屬的分類等級上，優勢最明顯的是交鏈孢屬(Alternaria Nees)，共有6株，占總菌株17．6%，其次是腐霉屬(Pythium)，共有5株，占菌株總數的14．7%。

表1 青陽參植物內生菌種群組成

3 結論

通過對青陽參植物內生菌的分離、鑒定，發現其內生菌種類多、數量大，微生物資源豐富。該研究不僅為發現新種，而且為篩選出具有生物活性天然產物的內生菌提供了豐富的資源。在青陽參植物不同的組織中內生菌有不同的分布，表現出一定的組織專一性。這可能與不同組織的生理結構和活性物質有關。鑒于內生真菌能夠產生與宿主植物相同或相似活性代謝產物，該研究將有利于促進植物內生真菌資源的研究與應用。隨著野生青陽參植物的日益減少，從內生真菌出發，研究內生真菌與其的相互關系，篩選能夠產生與宿主類似活性化合物的菌株，將具有重要的研究意義和應用意義。總之，隨著我國的傳統野生藥用植物資源的日漸枯竭，通過對藥用植物內生菌的分類學、生態學、代謝產物化學等進行系統的研究，將會極大地促進藥用植物資源的開發和利用。

研究中存在的問題主要在于該次試驗用的標本植株量較少，也未對不同區域、不同季節植株進行比較。內生菌的鑒定還需要采用分子生物學手段如16SrRNA、18SrRNA和ITS序列分析等進一步鑒定。這些工作還有待進一步研究。隨著研究范圍的擴大和研究的深入，更多的青陽參植物內生菌將會被發現、應用。

［1］RUBALCAVA M L M，BAUTISTA B E H，ESTRADA M J，et al．Naphthoquinone spiroketal with allelochemical activity from the newly discovered endophytic fungus Edenia gomezpompae［J］．Phytochemistry，2008，69:1185－1196．

［2］RUKACHAISIRIKUL V，SOMMART U，PHONGPAICHIT S，et al．Metabolites from the endophytic fungus Phomopsis sp．PSU-D15［J］．Phytochemistry，2008，69:783 －787．

［3］黎麗云，殷志琦，張慶文，等．云南民間藥青陽參的研究進展［J］．海峽藥學，2011，23(4):1 －5．

［4］王斌，王德斌，翟書華，等．云南青陽參遺傳多樣性的AFLP研究［J］．中草藥，2011，42(5):985 －989．

［5］楊竹雅，普春霞，錢子剛．青陽參及其近緣種的RAPD研究［J］．中國現代應用藥學雜志，2009，26(7):562 －566．

［6］楊清香，謝永生，張昊，等．懷地黃活性內生菌的分離鑒定及抗菌抗腫瘤活性［J］．微生物學通報，2010，37(10):1467 －1474．

［7］東秀珠，蔡妙英．常見細菌系統鑒定手冊［M］．北京:科學出版社，2001．

［8］布坎南R E，吉本斯N E．伯杰細菌鑒定手冊［M］．中國科學院微生物研究所翻譯組，譯．8版．北京:科學出版社，1984．

［9］魏景超．真菌鑒定手冊［M］．上海:上海科學技術出版社，1982．

［10］戴芳瀾．真菌的形態和分類［M］．北京:科學出版社，1987．

［11］邵力平，沈瑞祥，張素軒．真菌分類學［M］．北京:中國林業出版社，1984．