高溫木質素分解菌的分離、篩選及鑒定

張 亮，林 寧，闞 立

(1．南京師范大學泰州學院化學與生物工程學院，江蘇泰州225300;2．泰州機電高等職業技術學校，江蘇泰州225300)

木質素是由苯丙烷結構單元通過醚鍵和碳碳鍵連接而成的聚酚類三維網狀高分子芳香族化合物，是構成植物細胞的主要物質，約占植物體干重的20%。它是非常豐富的碳素資源［1］。據估測，全球每年可產生約6×1014t木質素，主要存在于農作物廢棄秸桿和工業造紙材料中。木質素分子空間三維結構非常復雜，在自然界中很難被微生物分解利用［2］。因此，高效降解木質素，使其資源化，日益引起人們的重視。

目前，木質素的微生物分解是由真菌、細菌等各種微生物群落共同作用的結果［3］。其中，木質素的微生物分解研究主要集中在以白腐真菌為代表的真菌上。白腐真菌能夠分泌胞外氧化酶降解木質素，包括木質素過氧化物酶(Lignin peroxidase，LiP)、錳過氧化物酶(Manganesedependent peroxidase，MnP)和漆酶(Laccase)，因此，它被認為是最主要的木質素降解微生物。雖然白腐真菌具有較好的分解效果，但是它生長緩慢、產酶量低的特點使其難以推廣到工業化生產應用。因此，有必要尋找新途徑來實現木質素的快速分解。在木質素的降解過程中，細菌發揮一些關鍵性作用，如支鏈的改性、環開裂和解聚等，并且由于細菌的生長周期短，易培養，適合大規模生產應用。因此，細菌在木質素分解中的作用不容忽視［4］。

在細菌分解木質素的研究中，對木質素有降解能力較強的細菌主要包括鏈霉菌(Streptomyces)、節桿菌(Arthrobacter)、小單孢菌(Micromonospora)等放線菌，還有假單胞菌(Pseudomonas)、黃桿菌(Flavobacterium)等非絲狀細菌［5］。這些細菌能夠分解不同聚合形態的木質素，在木質素降解的不同階段發揮作用。但是，白腐菌、黃孢原毛平革菌、部分細菌等屬于低溫木質素降解菌。雖然降解木質素能力強，但農作物秸稈發酵溫度較高。這些菌在高溫條件下不易存活，在此特殊環境中對木質素的降解率非常低，因此篩選高溫、產酶活性強、發酵周期短的木質素分解菌具有重要意義。以新鮮馬糞為供試材料，筆者篩選出高溫木質素分解菌，并且對其產酶活性進行測定，通過16SrDNA測序對目的菌株進行鑒定，以期為木質素分解菌的選育和菌劑的制備提供菌種資源。

1 材料與方法

1．1 菌種來源 對采自泰州市動物園新鮮的馬糞進行分離、獲取。

1．2 培養基 菌種篩選培養基(BM培養基)組成為:酵母浸出液 10 g，葡萄糖 20 g，木質素 2．5 g，瓊脂 15 g，水 1 000 ml，pH 7．0。產酶培養基(LB液體培養基)組成為:酵母膏5 g，胰蛋白胨 10 g，氯化鈉10 g，水 1 000 ml，pH 7．0。

1．3 菌種的分離與篩選

1．3．1 初篩。將采集到的樣品在LB培養基中富集后，采用平板梯度稀釋法，吸取0．2 ml菌懸液均勻涂布在BM培養基上，在55℃條件下培養2～3 d，觀察透明圈的大小，并且記錄其直徑。

1．3．2 復篩。挑取產生透明圈直徑較大菌株的一個單菌落，接種到產酶培養基中培養過夜后，離心，上清液即為粗酶液，在BM培養基中打若干小孔，每個孔加入100μl粗酶液，55℃培養4 h，然后用濃度1%三氯化鐵和鐵氰化鉀按照1∶1配制(現配現用)，染色約30 min，用濃度0．9%生理鹽水脫色，觀察透明圈的大小，并且記錄。篩選出4株透明圈直徑較大的菌株，保存于LB固體培養基中，備用。

1．4 粗酶液的制備及活性測定 從LB固體培養基挑取菌種，接種于50 ml的LB培養基中，55℃搖床培養過夜。從種子培養基中吸取5μl，轉接于5 ml種子培養基中，培養至OD到0．6左右。12 000 r/min，離心5 min，上清液即為粗酶液，4℃保藏，備用，測定相關酶活［6］。

(1)漆酶的測定。向20 ml的反應體系中加入18．6 ml的50 mmoL/L的乙酸－乙酸鈉緩沖液(pH 4．5)，將其在25℃預熱10 min后，加入0．4 ml的10 mmol/L的愈創木酚和1 ml的粗酶液，在反應溫度為25℃時測定465 nm處吸光度的增加。每分鐘內氧化1．0μmol愈創木酚所需酶量為一個酶活力單位。

(2)木質素過氧化物酶的測定。向3 ml反應體系中加入1．5 ml 125 mmol/L 酒石酸(pH 3．0)、10 mmoL/L 藜蘆醇1．0 ml、10 mmol/L 過氧化氫0．1 ml、粗酶液0．4 ml，加入過氧化氫后啟動反應，在310 nm處測定吸光度的增加。每分鐘內氧化1．0μmol藜蘆醇所需酶量為一個酶活力單位。

(3)錳過氧化物酶的測定。反應體系中含有50 mmol/L乳酸鈉緩沖液(pH 4．5)3．4 ml、1．6 mmol/L 硫酸錳溶液 0．1 ml、粗酶液0．4 ml，預熱至 37 ℃ 后加入 1．6 mmol/L 雙氧水0．1 ml啟動反應，在室溫條件下測定240 nm處紫外光反應3 min時OD的改變。每分鐘內氧化1．0μmol的Mn2+轉化成Mn3+所需酶量為一個酶活力單位。

1．5 目的菌株的鑒定 采用CTAB法提取細菌總DNA［7］;分別利用細菌16SrDNA通用引物F27/R1492進行PCR擴增。PCR反應體系(20μl):DNA模板3μl;PCR樣液10μl;27F(20 μmol/L)0．8 μl;1495F(20 μmol/L)0．8 μl;ddH2O5.4 μl。PCR條件為:95℃預變性5 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72 ℃ 延伸 1．5 min，30 個循環，72 ℃ 延伸 10 min。PCR產物經試劑盒純化后，送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

2 結果與分析

2．1 菌株的初篩 利用BM培養基初篩和復篩后，從馬糞中分離出產生透明圈較大的4株細菌。透明圈直徑見表1，其中X-2的透明圈直徑最大，其透明圈直徑與菌落直徑比值也最大。

表1 所篩菌株的透明圈直徑

2．2 菌株的復篩 對4株菌株漆酶、過氧化物酶和錳過氧化物酶3種酶活進行測定。由表2可知，菌株M-2產漆酶和錳過氧化物酶活性最強，M-4菌株產過氧化物酶活性最強。因此，選擇M-2菌株進行后續種屬鑒定。

2．3 目的菌株的鑒定 通過對M-2菌株的16SrDNA序列進行比對后，發現該菌株的16SrDNA序列與假單胞菌屬的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)同源性最高，序列相似性為85%(圖1)。因此，最終確定M-2菌株為假單胞菌屬的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。

表2 高溫木質素分解菌的產酶活性 U/ml

3 討論

通過初篩和復篩，從馬糞中獲得4株具有分解木質素的菌株，其中M-2的產酶活性較強。經16SrDNA遺傳學鑒定，確定M-2為假單胞菌屬的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。菌株M-2在高溫條件下具有生長速度快和產酶活性強的能力。有研究表明，在沒有外界添加任何外源碳氮源，將分離獲得的芽孢桿菌接種到秸稈木質素中進行堆積發酵，表現出較強的降解作用。通過玉米秸稈16 d的發酵，木質素降解率可達24%［8］。

我國每年產生大量的農作物秸稈。這些秸稈資源僅有很少部分作為動物飼料、人造板原料和食用菌栽培基質原料［9－10］，其余大部分資源被農民就地焚燒、四處堆放。這不僅造成生物資源的極大浪費，而且嚴重破壞生態環境［11］。秸稈中含有大量的木質素和纖維素，在常溫下難以降解。因此，后續可以將分離獲得的高溫木質素分解中用于農作物秸稈的堆積發酵，從而快速、高效、無污染地處理農作物秸稈。

［1］李成翠，李術娜，朱寶成．高活性木質素降解菌株T-8的分離、篩選與鑒定［J］．河北農業大學學報，2010，33(6):57 －62．

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［3］冀珍芳，石淑蘭．木質素的微生物降解［J］．廣西輕工業，2002，15(1):4－5．

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［7］TUOMELA M，OIVANENL P，HATAKKA A．Degradation of synthetic 14C-lignin by various white-rot fungi in soil［J］．Soil biology ＆ biochemistry，2002，34(11):1613 －1620．

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［11］席北斗，劉鴻亮，孟偉，等．垃圾堆肥高效復合微生物菌劑的制備［J］．環境科學研究，2003，16(2):58 －64．