濕法糖基化改性對南極磷蝦蛋白質功能特性的影響

劉 穎，馮 實，石彥國，曲映紅，劉志東，高 飛，馬慶保

(1．哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱150076;

2．上海海洋大學食品學院，上海201306;3．中國水產科學研究院東海水產研究所，上海200090)

南極磷蝦(Euphausia superba)作為一種生物資源量巨大、潛在的優質動物性蛋白質資源，具有良好的開發應用前景［1，2］。近年來，南極磷蝦已成為食品科學、醫學、營養學和藥學等學科的研究熱點之一。國內外圍繞南極磷蝦蛋白質開展了相關研究，但關于南極磷蝦蛋白質的功能特性及其改性的研究報道較少。在前期開展南極磷蝦蛋白質的功能特性的研究中發現，提取獲得的南極磷蝦蛋白質的功能特性與目前商品化應用的其他動物性蛋白質的功能特性存在較大的差距，限制了其在食品領域的應用。糖基化反應(Glycosylation)是一種通過Maillard反應的Amadori重排，將蛋白質分子氨基酸側鏈的自由氨基與還原糖分子末端的羥基發生羰氨反應，形成以共價鍵相連而成的糖－蛋白質復合物，屬于化學改性范疇。糖基化改性的方法主要有基于固相體系的干熱法和基于水相體系的濕熱法2種。李錚等［3］研究發現乳清蛋白與低聚異麥芽糖反應改性后能夠有效降低α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性。Li Y等［4］研究發現大米蛋白經糖基化改性后，其溶解性和乳化性顯著提升。Liu Yan等［5］研究了美拉德反應對花生蛋白質功能特性的改善效果。作為一種新來源的海洋生物蛋白質，盡管南極磷蝦蛋白質具有一定的功能性質，但其較低的溶解性限制了其在食品工業的應用。因此，需要對南極磷蝦蛋白質進行改性，以擴大其應用領域。目前關于南極磷蝦蛋白質糖基化改性的研究鮮見報道。因此，在前期研究的基礎上，筆者以反應產物溶解性、吸水性、吸油性、乳化性和乳化穩定性等作為評價指標，分析糖基化改性時間對南極磷蝦蛋白質功能性質的影響，為糖基化改性提高其功能特性提供理論依據，以期為海洋生物來源蛋白質的改性提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器 南極磷蝦由上海開創遠洋漁業有限公司開裕號遠洋捕撈船于南極設得蘭群島海域捕獲，在－18℃條件下運回國內;南極磷蝦蛋白質提取采用堿溶酸沉法［6］;提取后的南極磷蝦蛋白質經真空冷凍干燥后于－80℃冰箱中保存備用;無水葡萄糖(上海源聚生物科技有限公司)、D-半乳糖(上海源聚生物科技有限公司)、D-木糖(上海源聚生物科技有限公司)、麥芽糖(上海源聚生物科技有限公司)、葡聚糖-10(生工生物工程股份有限公司);其他試劑均為分析純級及以上級別。

HWS-24型電熱恒溫水浴鍋，為上海齊欣科學儀器有限公司產品;TGl-16M高速臺式冷凍離心機，為湖南湘儀試驗儀器開發有限公司產品;721N型可見分光光度計為上海精密科學儀器有限公司產品;LABCONCO FreeZone?真空冷凍干燥機，為美國LABCONCO公司產品;Pro-250型勻漿機，為美國Pro Scientific公司產品。

1．2 方法

1．2．1 南極磷蝦蛋白質的糖基化改性。南極磷蝦蛋白質加入一定量的蒸餾水配制成蛋白質溶液，并按照1∶1的比例加入不同的糖基供體，室溫下混勻，將一部分上述溶液置于70℃的恒溫環境中分別反應15、30、45和60 min后取出，冷卻至室溫后測定其功能特性［7］。

1．2．2 蛋白質溶解性的測定。采用考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質含量。稱取0．50 g南極磷蝦蛋白質和0．50 g糖基供體并溶于15．00 ml蒸餾水中，混勻后離心(10 000 r/min、25 ℃)10 min，吸取上清液并稀釋 50 倍后，取1．00 ml蛋白質溶液于試管中，并加入5．00 ml考馬斯亮藍G－250試劑，測定595 nm 處的吸光度值［8－9］。

1．2．3 蛋白質吸水性的測定。稱取0．50 g南極磷蝦蛋白質和0．50 g糖基供體，并與15．00 ml水充分混勻，靜置30 min后離心(10 000 r/min、25℃、10 min)，記錄離心后上清液體積［10］。

1．2．4 蛋白質吸油性的測定。稱取0．25 g南極磷蝦蛋白質和0．25 g糖基供體，并與15．00 ml大豆油充分混勻，靜置30 min后離心(10 000 r/min、25℃、10 min)，記錄離心后上清液體積。

1．2．5 蛋白乳化能力的測定。以乳化活性指數(EAI)和乳化穩定性指數(ESI)來表示南極磷蝦糖基化改性蛋白質的乳化能力。稱取0．30 g南極磷蝦蛋白質和0．30 g糖基供體與30．00 ml水和10．00 ml大豆油充分混勻，10 000 r/min 勻漿1 min;由乳濁液底部吸取50．00μl液體，振蕩混勻后在第0 min 用0．10%SDS(W/V)稀釋至 5．00 ml，測定波長 500 nm處的吸光度A0，10 min后再次測定吸光度值A10。EAI和ESI分別按照以下公式進行計算［11］:

式中，A為500 nm處的吸光值;φ為油相體積分數(φ=2．303);c為蛋白質濃度(g/ml);A0和A10為乳狀液在0和10 min的吸光值。

1．2．6 蛋白質起泡能力的測定。稱取0．60 g南極磷蝦蛋白質和0．60 g糖基供體，配成濃度為20．00 mg/ml的蛋白質溶液，采用高速勻漿機勻漿1 min，結束后將液體快速轉移至量筒中，分別測定勻漿操作停止時泡沫體積和液體體積之和V0，操作停止10 min后的泡沫和液體總體積V10。分別按照以下公式計算起泡性(FC)和泡沫穩定性(FS):

1．3 數據處理 每個試驗重復3次。試驗數據采用Excel 2013軟件進行處理，試驗結果均以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2．1 改性時間對南極磷蝦蛋白質溶解性的影響 蛋白質的溶解性是評價蛋白質應用性的重要指標。從圖1可以看出，采用半乳糖、木糖和葡聚糖改性的南極磷蝦蛋白質溶解性隨著改性時間的延長，表現出下降的趨勢;采用麥芽糖改性的南極磷蝦蛋白質的溶解性隨著改性時間的延長而上升;采用葡萄糖改性的南極磷蝦蛋白質的溶解性隨著改性時間的延長表現出先升高后降低的趨勢。此外，不同糖基供體與南極磷蝦蛋白質反應產物的溶解性隨著反應時間變化的程度和速率也不完全相同。以葡萄糖和乳糖為糖基供體時，反應產物的溶解性在反應過程中隨著反應速率的加快而增強，反應45 min后葡萄糖與南極磷蝦蛋白質的產物溶解性達到最大值(19．00%)。此后，隨著反應時間的延長和產物的減少，溶解性降低。因為隨著糖基化反應的進行，親水性的糖基與蛋白質連接，反應產物的溶解性也隨之增大;當反應達到一定程度后，反應產物的產生達到“頂點”，其溶解性也隨之降低。以木糖和葡聚糖為大分子的糖基供體的還原性相對較弱，反應產物的溶解性相對較低。因此，蛋白質的糖基化改性必須選擇合適的糖基供體，嚴格控制反應條件和反應進程。

2．2 改性時間對南極磷蝦蛋白質吸水性的影響 蛋白質的吸水性是評價蛋白質吸附水能力的一項指標。影響蛋白質吸水性的因素主要包括氨基酸組成、蛋白質結構和表面極性/疏水性等。從圖2可以看出，采用葡萄糖、半乳糖和葡聚糖改性的南極磷蝦蛋白質的吸水能力呈現上升的趨勢;采用木糖和麥芽糖改性的南極磷蝦蛋白質的吸水性則表現為先上升后下降的趨勢。葡萄糖、半乳糖和麥芽糖與南極磷蝦蛋白質的反應較快，吸水性變化波動較為明顯。這可能是因為分子量較小的還原糖與南極磷蝦蛋白質分子結合時，初始階段反應速率較快，導致反應產物的吸水能力增強;隨著反應的進行，反應產物的產生減少，吸水能力降低。改性南極磷蝦蛋白質的吸水性最大值為采用半乳糖為糖基供體、改性時間 60 min，最大值為 8．20 ml/g。

2．3 改性時間對南極磷蝦蛋白質吸油性的影響 蛋白質的吸油性是表征蛋白質對脂質的吸收和保留能力的重要指標。從圖3可以看出。采用半乳糖和麥芽糖改性的南極磷蝦蛋白質的吸油性隨著改性時間的延長表現為上升的趨勢。這是由于糖基化改性導致南極磷蝦蛋白質原有的構象發生變化，高度規則、緊密的排列方式轉變為不規則、松散排列方式，增加了吸油性。葡萄糖、木糖和葡聚糖改性的南極磷蝦蛋白質的吸油性則隨著時間呈現出先上升后下降的趨勢。這可能是因為隨著改性時間的延長，南極磷蝦蛋白質變性增強，不溶性蛋白質增多，導致反應產物的吸油性降低。采用木糖為糖基供體，改性時間30 min時，改性南極磷蝦蛋白質的吸油性最大，為16．67 ml/g。

2．4 改性時間對南極磷蝦蛋白質乳化能力的影響 由于蛋白質具有兩親結構，同時具有親水性和親油性，但是由于未經改性的南極磷蝦蛋白質的溶解性較差限制了其乳化性。從圖4可以看出，采用葡萄糖和麥芽糖進行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質的乳化能力隨著改性時間的延長而提高，采用麥芽糖和葡聚糖進行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質的乳化性隨著改性時間的延長而降低，采用木糖進行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質的乳化性隨著改性反應的進行表現出先下降后上升的趨勢。采用葡萄糖為糖基供體，改性南極磷蝦蛋白質的乳化性最大值出現在改性時間60 min，最大值達10．33 m2/g。這是因為南極磷蝦蛋白質與葡萄糖發生聚合后，提高了其溶解性;同時，聚合后的產物側鏈殘基具有一定的疏水性，使得糖基化改性的南極磷蝦蛋白質能夠快速較好地吸附在油水界面。

從圖5可以看出，采用葡萄糖進行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質乳化穩定性隨著改性時間的延長而降低。這是由于南極磷蝦蛋白質與糖的反應初始階段，隨著反應溫度的升高，南極磷蝦蛋白質結構部分展開，糖基供體與南極磷蝦蛋白質受熱結合，促進南極磷蝦蛋白質的分子伸展，疏水性基團暴露，大大提高了溶液的乳化活性。但是，隨著反應時間的延長，一方面導致南極磷蝦蛋白質基團中的賴氨酸被破壞，另一方面引起南極磷蝦蛋白質結構的伸展，增加蛋白質分子間的相互作用，導致凝聚和沉淀，不利于蛋白質與糖基供體發生相互作用。采用木糖和葡聚糖進行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質，其乳化穩定性隨著改性時間的延長表現為先上升再下降的趨勢。這可能是因為這2種糖基供體在反應后期的產物(褐變產物)影響了其乳化穩定性。采用半乳糖和麥芽糖為糖基供體的糖基化產物其乳化穩定性隨著改性時間的延長表現為先下降再上升的趨勢。這是由于隨著糖基化反應的進行，南極磷蝦蛋白質所帶的凈電荷不斷增加，分子間的排斥增加，油水界面所形成的保護膜增厚，提高了乳化穩定性。采用葡萄糖為糖基供體，改性南極磷蝦蛋白質的乳化穩定性最高的值出現在改性時間15 min時，為89．93%。

2．5 改性時間對南極磷蝦蛋白質起泡能力的影響 泡沫的形成是由于水分子對空氣的包裹，空氣是非極性介質，而蛋白質是兩性分子。因此，它可以作為空氣－水表面的介質促成泡沫形成［12］。從圖6可以看出，采用半乳糖進行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質的起泡性隨著改性時間的增加而降低，采用葡萄糖和葡聚糖進行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質的起泡性呈現先上升后下降的趨勢;采用半乳糖和木糖進行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質，其起泡性呈現先下降后上升的趨勢;采用半乳糖為糖基供體時，改性南極磷蝦蛋白質起泡性的最大值出現在改性時間為15 min時，為25．11%。改性南極磷蝦蛋白質產物起泡性改善不明顯，可能是由于反應產物雖溶解度有所提高，但由于南極磷蝦蛋白質是一類結構緊密、剛性強、難于變形的大分子，因而無法迅速吸附在氣－水界面展開形成有序的蛋白質分子層，起泡能力差，其泡沫體積保留量也較少。

從圖7可以看出，采用葡萄糖、半乳糖、木糖和麥芽糖改性的南極磷蝦蛋白質泡沫穩定性隨著改性時間的延長表現出先降低后升高的趨勢。其中，采用葡萄糖、半乳糖和木糖進行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質，在改性時間為30～45 min時，發生泡沫完全消去的現象;采用葡聚糖進行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質，其泡沫穩定性則隨著改性時間的增長表現出先升高后降低的趨勢。結果表明，采用半乳糖為糖基供體，改性南極磷蝦蛋白質的泡沫穩定性在試驗條件下最好，改性時間為60 min時泡沫穩定性可達8．22%。

3 結論

采用不同的糖基供體對南極磷蝦蛋白質進行糖基化改性，其功能特性隨著時間的改變而存在較大差異。因此，可以根據應用領域不同或目的的不同，選擇最適的糖基供體和改性時間對南極磷蝦蛋白質進行糖基化改性。對改性時間而言，采用葡萄糖對南極磷蝦蛋白質進行糖基化改性可以獲得較高的溶解性，采用D-木糖對南極磷蝦蛋白質進行糖基化改性可以獲得較好的吸水性;采用葡萄糖改性的南極磷蝦蛋白質具有較好的乳化性。但是，在該試驗條件下糖基化改性南極磷蝦蛋白質的起泡性和泡沫穩定性還不夠理想，后續嘗試采用其他的改性方法開展南極磷蝦蛋白質的改性，以實現期望的功能特性，為南極磷蝦蛋白質的深度開發與利用提供參考。

［1］陳雪忠，徐兆禮，黃洪亮．南極磷蝦資源利用現狀與中國的開發策略分析［J］．中國水產科學，2009，16(3):451-458．

［2］劉勤，黃洪亮，李勵年，等．南極磷蝦商業化開發的戰略性思考［J］．極地研究，2015(1):31-37．

［3］李錚，羅永康，馮力更，等．乳清蛋白-低聚異麥芽糖的制備及其抗原性研究［J］．中國農業大學學報，2011，16(2):133-137．

［4］LI Y，LU F，LUO CR，et al．Functional properties of the Maillard reaction products of rice protein with sugar［J］．Food chemistry，2009，117:69-74．

［5］LIU Y，ZHAO GL，ZHAO M M，et al．Improvement offunctional properties of peanut protein isolate by conjugation withdextran through Maillard reaction［J］．Food chemistry，2012，131:901-906．

［6］張楠，布冠好，朱婷偉，等．糖基化反應對大豆蛋白-乳糖復合物抗原性及結構的影響［J］．現代食品科技，2015，31(8):117-121．

［7］CROZO-MARTíNEZ M，HERNANDEZ-HERNANDEZ O，VILLAMIEL M，et al．In vitro bifidogenic effect of maillard-type milk protein-galactose conjugates on the human intestinal microbiota［J］．International dairy journal，2013，31(2):127-131．

［8］王軍，王忠合，宋鳳艷，等．糖基化反應對雞蛋清蛋白與低聚麥芽糖交聯物活性和功能性的影響［J］．現代食品科技，2014，30(10):24-29．

［9］WANGX，ZHANG L S，DONG L L．Inhibitory effect of polysaccharides from pumpkin on advanced glycation end-products formation and aldose reductase activity［J］．Food chemistry，2012，130(4):821-825．

［10］OLIVERCM，MELTONL D，STANLEY RA．Creating proteins with novel functionality via the Maillard reaction:A review［J］．Critical reviews in food science and nutrition，2006，46(4):337-350．

［11］AGYARE K K，ADDO K，XIONG Y L．Emulsifying and foaming properties of transglutaminase-treated wheat gluten hydrolysate as influenced by pH，temperature and salt［J］．Food hydrocolloids，2009，23(1):72-81．

［12］王冠蕾．糖基化改性提高醇法大豆濃縮蛋白凝膠性的研究［J］．現代食品科技，2012，28(11):1478-1483．