兔源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

徐為中，王 芳，胡 波，范志宇，魏后軍，宋艷華，薛家賓，仇汝龍，劉 星

(江蘇省農業科學院獸醫研究所/農業部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室/國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇南京210014)

多殺性巴氏桿菌屬于革蘭氏陰性菌，是人類和多種動物病原菌之一，可以引起多種畜禽巴氏桿菌病，如奶牛和水牛出血性敗血癥、綿羊和山羊出血性肺炎、鳥類禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、兔傳染性鼻炎及人類伴侶動物貓狗咬抓相關的疾病［1-2］。家兔普遍存在巴氏桿菌病，臨床主要表現為嚴重呼吸道病變、中耳炎、敗血癥、局部膿腫等［3］。此病是引起斷奶到成年兔死亡的主要傳染病。

多殺性巴氏桿菌根據莢膜抗原分為A、B、D、E和F 5個血清型［4］。兔的巴氏桿菌病大多由A型引起，少數由D型引起，由F型引起兔巴氏桿菌病也有報道［5-9］。筆者從近幾年周邊地區(安徽、上海、江蘇)送檢急性死亡家兔肺臟和肝臟中分離出5株細菌，進行菌落形態觀察、涂片鏡檢、生化鑒定，并對多殺性巴氏桿菌的ATP合成酶基因進行檢測，根據多殺性巴氏桿菌A、B、D、E和F莢膜血清型特異性基因設計引物進行PCR分型［10］，最終確定分離的5株細菌均為莢膜血清A性多殺性巴氏桿菌，同時進行藥敏試驗，可為在臨床上該病的防控提供依據。

1 材料與方法

1．1 病死兔來源 病死兔來源于安徽、上海和江蘇，送檢急性死亡家兔，采集肝和肺組織。

1．2 試驗動物 20 g左右的昆明小鼠12只，由揚州大學實驗動物中心提供。

1．3 酶及其他試劑 Taq DNA聚合酶、DL2000核酸Marker、DNA凝膠回收試劑盒，均購自大連寶生物(TaKaRa)有限公司;柱式細菌DNAout試劑盒，購自天恩澤公司;生化鑒定管及藥敏試紙購自上海金穗生物科技有限公司;馬丁肉湯培養基和革蘭氏染色液試劑盒，購自青島海博生物技術有限公司。

1．4 細菌的分離培養和形態觀察 剖檢病死兔，采集典型病理變化的肺、肝組織劃線接種于馬丁瓊脂平皿，37℃恒溫培養18 h，進行菌落形態觀察，并對單菌落涂片、染色和鏡檢，挑取單個典型菌落接種于血平皿，置于37℃條件下培養18～24 h觀察其溶血性。

1．5 生化試驗 將分離到的細菌接種于馬丁肉湯中，37℃條件下培養12 h，按照常規方法進行麥芽糖、甘露醇、半乳糖、鼠李糖、菊糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、山梨醇、水楊酸、乳糖、蔗糖、脲酶試驗、硫化氫試驗、MR試驗、VP試驗、接觸酶試驗和吲哚試驗生化鑒定。

1．6 PCR鑒定及分型 將分離菌株，接種于馬丁肉湯中37℃振蕩培養過夜，所得的菌液用來提取模板DNA，DNA的提取按照柱式細菌DNAout試劑盒說明書進行。

PCR鑒定參考實驗室根據對多殺性巴氏桿菌ATP合成酶atpB建立的PCR擴增方法，引物由上海英濰捷基生物有限公司合成:P1:5′-TTCTGTTCGCTTCATCCT-3′，P2:5′-CTGTTCTGTTCGCTTCATC-3′，預期擴增的DNA產物片段大小為 1 141 bp［11］。

PCR 反應體系:模板 DNA4．0 μl，Taq聚合酶0．4 μl，10 ×Taq Buffer 2．5 μl，P1、P2 引物(20 umol/L)各1．0 μl，dNTPs(2．5 mmol/L)2．0 μl，MgCl2(25 mmol/L)2．5 μl，H2O 11．6 μl。PCR反應條件:94℃變性4 min;94℃ 35 s，54℃ 35 s，72℃ 60 s，35個循環;72℃ 10 min，將PCR產物于4℃條件下保存。

PCR產物的凝膠電泳鑒定:PCR產物經1．2%的瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的片段后送至上海英濰捷基公司測序。

分型多重PCR鑒定:參考Townsend報道根據多殺性巴氏桿菌 A、B、C、D、E莢膜血清型特異性基因 hyaD-hyaC、bcbD、dcb、ecbJ、fcbD 設計引物 PmA、PmB、PmD、PmE、PmF 上述引物由上海英駿生物技術有限公司合成［10］。引物序列及擴增的大小見表1。

表1 多殺性巴氏桿菌基因擴增用引物

多殺性巴氏桿菌分型多重PCR采用與上述PCR鑒定多殺性巴氏桿菌ATP合成酶atpB相同的反應體系和反應條件，將PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

1．7 小鼠致病性試驗 將分離的菌株在含血清馬丁肉湯中培養過夜，用生理鹽水連續10倍稀釋計數，將昆明小鼠隨機分為5組，每組2只，腹腔注射0．5 ml稀釋過的菌液，內含8個細菌，對照組注射生理鹽水0．5 ml。

1．8 藥敏試驗 無菌吸取0．2 ml馬丁肉湯細菌培養液加入到馬丁瓊脂培養皿內，用無菌玻璃棒均勻涂開，待培養基表面液體稍干后，將藥敏紙片均勻貼于瓊脂表面，每塊平皿貼4張藥敏紙片，37℃恒溫培養24 h后，測量藥敏紙片的抑菌直徑。按照不同抗菌藥標準，對比抑菌圈直徑大小，結果評定為高敏、中敏和不敏感。

2 結果與分析

2．1 形態及培養特性 在馬丁瓊脂平板培養18～24 h后，呈現圓形、邊緣整齊、光滑、半透明的灰白色菌落，鮮血瓊脂平板上培養不溶血。細菌涂片染色為兩極濃染的革蘭氏陰性球桿菌。

2．2 生化試驗結果 5株細菌接種生化管，37℃培養24 h后，不能發酵鼠李糖、水楊酸、菊糖乳糖;能發酵麥芽糖、甘露醇、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖和蔗糖，產酸不產氣;脲酶試驗結果為陰性;MR試驗結果為陰性;VP試驗結果為陰性;接觸酶試驗結果為陽性;硫化氫試驗結果為陽性;吲哚試驗結果為陽性。5株分離細菌的生化特性與多殺性巴氏桿菌相符。

2．3 小白鼠致病性試驗 活菌注射的試驗組小鼠24 h內全部發病死亡，小白鼠剖檢后可見肺出血、脾腫大淤血、肝臟有散在白色壞死灶，取死亡小鼠肝臟接種于添加加血清血紅素馬丁瓊脂平板，37℃恒溫培養12～20 h，長出半透明的小菌落。挑單菌落涂片染色鏡檢，可見兩極濃染的革蘭氏陰性球桿菌，對照組實驗動物健康存活。

2．4 藥物敏感性試驗 藥物敏感性試驗結果表明，分離菌對環丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、恩諾沙星和磺胺六甲氧嘧啶敏感，對強力霉素、四環素中敏，對痢特靈、慶大霉素和卡那霉素耐藥。

2．5 PCR鑒定及分型結果

2．5．1 多殺性巴氏桿菌ATP合成酶atpB的PCR鑒定。對分離的5個菌株提取DNA，進行多殺性巴氏桿菌ATP合成酶atpB PCR擴增，PCR產物用1．2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，在1 141 bp處均出現特異性目的條帶(圖1)，大小與預期片段一致，將目的條帶回收測序的結果與GenBank數據庫上公布的多殺性巴氏桿菌ATP合成酶atpB序列進行Blast比對，同源性達到99．7%，確定分離的5菌株均為多殺性巴氏桿菌。

2．5．2 多重PCR莢膜的血清分型。對從分離的5個菌株提取的DNA經多殺性巴氏桿菌分型多重PCR鑒定，PCR產物經過1%的瓊脂糖凝膠電泳，在1 044 bp處有1個特異性片段(圖2)，據此初步鑒定分離的5株細菌均為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌。

3 討論

家兔多殺性巴氏桿菌病是引起斷奶到成年兔死亡的最主要傳染病，家兔的巴氏桿菌病多數為A型引起，少數為D型引起，然而不同國家流行的菌株有所不同，在我國兔群中流行的主要血清型是A型［12］，而關于家兔巴氏桿菌莢膜血清型F型的報道非常少［9］。不同血清型多殺性巴氏桿菌之間沒有或僅有較少的交叉保護性［13］，因此必須對本地流行的多殺性巴氏桿菌血清型加以監測，根據當地監測結果才能更好地指導該病的防治。筆者對送檢急性死亡兔進行病原菌的分離培養與鑒定，結果發現分離到的5株多殺性巴氏桿菌全部為A型，我國家兔巴氏桿菌商品疫苗也都是A型菌株制備的滅活疫苗，因此疫苗的免疫預防該病是首選方案。

在多殺性巴氏桿菌分離鑒定中采用了生化試驗與PCR方法相結合，二者的符合率達到100%，二者結合使用，可以對分離的多殺性巴氏桿菌進行快速鑒定分型，提高診斷效率和準確性，在臨床診斷和流行病學調查具有較好的借鑒參考價值。

在此次分離巴氏桿菌動物致病性試驗中，8個細菌注射劑量試驗組小鼠24 h內全部發病死亡，說明分離的菌株對動物具有強致病性，應當重視對A型家兔多殺性巴氏桿菌病的預防，可以減少家兔的死亡，提高家兔養殖的經濟效益。藥敏試驗結果表明，分離的5株巴氏桿菌對環丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考和磺胺六甲氧嘧啶等藥物敏感素，臨床上可首選這些藥物進行治療。

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