納升級反相液相色譜－串聯質譜法分析麥氏弧菌蛋白質組

李正義，賈俊濤*，姜英輝，王 駿，羅 繼，崔淑華，徐 彪，梁成珠，張鐵軍

(1．山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山東青島266002;2．AB SCIEX公司上海應用實驗室，上海200233)

麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii)是國際公認的11種致病性弧菌之一，也是引起感染性腹瀉的致病菌［1］，主要能引起人類的創傷性感染和敗血癥［2］。目前對于麥氏弧菌檢測方法的研究主要集中在傳統的分離鑒定和分子生物學技術等方面［3］，而對提取的麥氏弧菌蛋白進行系統分析目前未見報道。國內外研究人員主要采用二維電泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrum，MALDI-TOF MS)技術對細菌提取蛋白的酶解產物進行分析［4－5］。Khot等利用 MALDI-TOF MS技術采集志賀氏菌屬和大腸桿菌的蛋白質種屬生物標記物，得到15個屬標記物和12個種標記物，能夠高通量有效區分大腸桿菌和志賀氏菌屬［6］。

納升級反相液相色譜－串聯質譜法(nano-RPLC-MS/MS)檢測生物大分子具有極高的靈敏度和精確度，在生物醫學領域特別是在蛋白質分析中得到了廣泛的應用。Zhang等通過比較人類胃腺癌細胞與正常胃黏膜上皮細胞，利用納升級反相液相色譜－串聯質譜法鑒定78種蛋白，發現細胞系膜聯蛋白A1的表達上調與人類胃腺癌密切相關［7］。于海洋等利用納升級反相液相色譜－串聯質譜法系統分析了錦燈籠果實的提取蛋白質的酶解產物，數據庫檢索到60種蛋白［8］。陳霞等結合聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了蜈蚣提取蛋白質的膠內酶解和直接酶解產物，膠內酶解鑒定到72種蛋白質，直接酶解鑒定到97種蛋白質［9］。筆者引入蛋白質組學研究方法，采用了高靈敏度的納升級反相液相色譜－串聯質譜法，對分離自美國龍蝦的一株麥氏弧菌提取蛋白質進行溶液內酶解，對直接酶解產物進行分析，并對鑒別到的蛋白質的生物進程、細胞組分及功能活性進行分析，較系統地研究了麥氏弧菌提取蛋白質，為麥氏弧菌蛋白質組學的深入研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1．1 材料 納升級液相色譜系統:Eksigent NanoLC-Ultra?液相系統;高分辨質譜系統:TripleTOFTM5600+，配有電噴霧離子源(ESI)和ProteinPilot 4．5蛋白質分析軟件(美國AB Sciex公司)，假陽性率控制在小于1%。

十二烷基磺酸鈉(SDS)，購于SIGMA公司;乙二胺四乙酸(EDTA)、甲基磺酰氟(PMSF)，購于Amesco公司，級別為ultra pure grade;離心機為德國eppendorf centrifuge公司;牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍染料G250、蛋白分子量Marker，購于生工生物工程(上海)有限公司;二硫蘇糖醇(DTT)、尿素(UREA)、碘乙酰胺(IAM)、四乙基溴化銨(TEAB)，購于Promega公司;胰蛋白酶(Trypsin，Promega質譜測序級);乙腈、甲酸等質譜用試劑均為質譜級(德國Merck公司);該試驗中涉及到的其他化學試劑為分析純。

麥氏弧菌F5-1，分離自進口美國的美國龍蝦(Homarus americanus)腹部。

1．2 麥氏弧菌總蛋白的提取 麥氏弧菌在4℃，10 000 r/min，離心5 min，收集菌細胞沉淀。菌細胞置于1．5 ml離心管中，加入300μl裂解液，超聲5 min。超聲條件:起動時間2 s，超聲間隔3 s，超聲功率180 W;裂解液緩沖液的配制:8 mol/L 尿素，30 mmol/L HEPES，1 mmol/L PMSF，2 mmol/L EDTA，10 mmol/L DTT。超聲后，離心30 min，取上清，加入DTT至終濃度10 mmol/L。56℃水浴1 h，取出后，迅速加入IAM至終濃度55 mmol/L，暗室靜置1 h，加入4倍于樣品溶液體積的預冷丙酮，－20℃沉淀3 h以上。離心30 min，取沉淀，加入700μl的復溶緩沖液，終濃度為50%TEAB，0．1%SDS。超聲3 min助溶，超聲條件同上。離心30 min，取上清。提取蛋白樣品使用bradford法對蛋白進行定量，SDS-PAGE檢測蛋白質提取情況。

1．3 麥氏弧菌蛋白質直接酶解 取麥氏弧菌蛋白約50μg，加1 mol/L DTT至終濃度10 mmol/L;蛋白溶液pH為8．0，56℃孵育60 min，冷卻至室溫。加入1 mol/L IAM至終濃度60 mmol/L，室溫暗 處 孵 育 60 min。加 入 50 mmol/L NH4HCO3稀釋尿素至終濃度不超過1 mol/L，按照胰蛋白酶與麥氏弧菌蛋白的量之比在1∶20 ～1∶100，加入1μg胰蛋白酶，37℃孵育過夜，再次加入同等劑量的胰蛋白酶，室溫孵育24 h，得到麥氏弧菌總蛋白直接酶解液。

1．4 NanoL C-MS/MS分析 直接酶解液加入0．1%甲酸溶液，10 000 r/min，4℃離心后取上清液注入Nano LC-MS/MS儀器分析。

液相為Eksigent NanoLC-Ultra液相系統，色譜條件為:樣品以300 nl/min上樣到C18預柱上(Nano cHiPLC Trap column，200 μm ×0．5 mm ChromXPC18-CL 3 μm120 ?)，然后保持流速沖洗脫鹽10 min。分析柱是cHiPLC反相柱(Nano cHiPLC column，75 μm × 15 cm ChromXP C18-CL 3 μm 120 ?)，上樣量5μl，流動相A:2%乙腈(0．1% 甲酸)，B:98%乙腈(0．1%甲酸);流速300 nl/min，自動進樣。梯度洗脫條件為:0 ～55 min，5% ～23%B;55～75 min，23% ～52%B;75～76 min，55% ～80%B;76 ～80 min，80%B;80 ～90 min，80% ～5%B，分析時間為90 min。

質譜檢測條件:AB SCIEX TripleTOFTM5600+，ESI源，正離子掃描方式，離子源氣體1:27．58 kPa，氣簾:206．84 kPa，離子噴霧電壓:2．3 kV。一級質譜掃描范圍m/z350～1 250，250 ms，選擇一級圖譜最高的40個峰進行二級掃描。IDA(information dependent acquisition)掃描范圍m/z100～1 500，電荷數為2～5的母離子被選擇進行MS/MS分析。

1．5 麥氏弧菌蛋白鑒定 試驗得到的質譜數據結果，在uniprot網站中麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii CIP 69．14)蛋白質數據庫中進行檢索，數據庫下載于網址“http://www．uniprot．org/uniprot/?query=Vibrio+metschnikovii＆sort=score”，包含3 089條蛋白信息。數據庫檢索軟件為Protein-Pilot 4．5，參數的選擇如下:樣本類型:Identification;半胱氨酸烷基化:IAA;蛋白消化:Trypsin;儀器設備:TripleTOFTM5600+;特殊因子:None;種類:None;關注信息:Biological modifications Amino acid subsitution;數據庫:Vibiro metschnikovii;搜索方式:Thorough;FDR統計分析:Yes。

2 結果與分析

2．1 提取蛋白的分析 麥氏弧菌提取蛋白使用bradford法對蛋白進行定量，定量標準曲線為:y=0．193x+0．004，R2=0．995，其中y為吸光度(595 nm)，x為BSA濃度，定量濃度為1．5 μg/μl。上清液 SDS-PAGE 電泳上樣，上樣量為10 μl，電泳結果見圖1。

2．2 質譜分析及數據庫檢索 采用Nano LC-MS/MS對麥氏弧菌提取蛋白進行分析。上樣量7．5μg，采集時間90 min，IDA掃描峰數為40時，一級圖譜響應值約2．5×107，二級圖譜為42 027張(圖2)，色譜質譜圖結果顯示，在梯度時間內多肽組分分離良好，為質譜在單位時間內采集更多的數據提供了有利條件。

質譜分析的數據在uniprot網站中麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii CIP 69．14)蛋白質數據庫中進行檢索，檢索結果通過嚴格標準進行篩選(1%FDR，即所有鑒定到的蛋白質其可靠性在99%以上)，直接酶解鑒定到的蛋白數量為1 538個。鑒定的蛋白主要是參與代謝進程的酶類，如Glutamate dehydrogenase，Phosphoglycerate kinase;參與細胞生理過程的酶類，如 Adenosine deaminase，Na(+)-translocating NADH-quinone reductase;參與生物調節的酶類，如Lon protease，Zinc metalloprotease等。通過Gene Ontology分析(GO分析)，對鑒定到的蛋白通過BLAST提取基因進行分析，考察了麥氏弧菌分離菌株F5-1提取蛋白的分子功能、生物進程和細胞組分，具體分布見圖3。

由圖3A分子功能可見，具有催化活性的功能蛋白占較大比例，還有結合活性、結構分子活性、轉錄調節因子活性等功能蛋白。鑒定到的具有催化活性的蛋白質，如磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase)、葡萄糖-6-磷酸異構酶(Glucose-6-phosphate isomerase)、磷酸丙糖異構酶(Triosephosphate isomerase)、果糖二磷酸醛縮酶(Fructose-bisphosphate aldolase)等大部分是糖代謝相關蛋白，為麥氏弧菌細胞提供能量。

麥氏弧菌中具有結合活性蛋白，主要是核酸結合蛋白，如GTP結合蛋白(GTP-binding protein)、DNA結合蛋白(DNA-binding protein)、ABC轉運蛋白的ATP結合蛋白(ABC transporter ATP-binding protein)等，與核酸結合的蛋白質負責細胞內DNA分子遺傳信息的組織、復制和閱讀。

該研究還鑒定到絲氨酸蛋白激酶(Serine protein kinase，SPK)，一類能使特定底物蛋白中絲氨酸羥基磷酸化的酶。SPK通過催化酶、受體、運輸蛋白、調節蛋白、核內蛋白等多種功能蛋白的磷酸化，改變蛋白的構象，調節細胞多種生命活動過程［10－11］。作為蛋白激酶大家族中的一員，SPK過去曾被認為是真核生物所獨有的，大量的相關研究也集中在真核生物中［12－13］，之后在黃色粘球菌、集胞藻、革蘭氏陽性無乳鏈球菌等原核生物中陸續被發現［14－16］。研究發現，SPK可能參與結核分枝桿菌致病過程中的多個環節，并與致病性相關［17］，這提示麥氏弧菌的致病性可能有絲氨酸蛋白激酶的參與。

3 結論

研究細胞內全部蛋白質的存在及其活動方式的學科即為蛋白質組學(proteomics)［18］，主要包括結構蛋白質組學和功能蛋白質組學。蛋白質組學的研究對象通常為具有高度復雜性的蛋白質或多肽的混合物，其技術可分為分離和鑒定2個方面。其中分離的技術手段以雙向凝膠電泳和液相色譜為核心，而鑒定則主要依靠質譜技術。雙向凝膠電泳結合質譜技術作為研究蛋白質組學最廣泛技術手段，其局限性在于分離能力有限、存在歧視效應、操作程序復雜等缺陷，對于分析動態范圍大、低豐度以及疏水性蛋白質的研究往往很難得到滿意的結果。利用高效液相色譜技術分離蛋白質，并用高分辨質譜鑒定收集的組分，是最近發展起來的研究蛋白質組學有效技術手段［19－21］。

蛋白質組學研究要求有高分辨率的蛋白質分離及準確、靈敏的質譜鑒定技術。該研究采用納升級反相液相色譜－串聯質譜技術分析麥氏弧菌總蛋白的方法，具有高通量、高靈敏的特點，高分辨質譜系統分析了麥氏弧菌提取蛋白直接酶解肽段，數據庫檢索得到預測蛋白質氨基酸序列，通過與數據庫中已知序列比對，鑒定到1 538種蛋白，蛋白鑒定數目約占物種Vibiro metschnikovii CIP 69．14總蛋白數的50%，進一步分析了部分提取蛋白質的生物學功能，為麥氏弧菌功能蛋白質組的深入研究奠定了基礎。

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