細菌培養(yǎng)法與PCR法對細菌性陰道炎輔助診斷的價值

鄧石雄，劉映云

(增城市人民醫(yī)院檢驗科，廣東 增城 511300)

細菌培養(yǎng)法與PCR法對細菌性陰道炎輔助診斷的價值

鄧石雄，劉映云

(增城市人民醫(yī)院檢驗科，廣東 增城 511300)

目的 比較細菌培養(yǎng)法與PCR法診斷細菌性陰道炎的價值。方法選擇我院2012年10月至2014年10月收治的208例細菌性陰道炎患者，采集陰道分泌物后，分別用PCR法與細菌培養(yǎng)法鑒別細菌種類，比較兩種方法的靈敏度、特異性。結(jié)果檢出的致病菌種以陰道加德納菌最常見，占61.8%。PCR法檢出陽性率為81.7%，明顯高于細菌培養(yǎng)法的65.4%，且PCR法檢靈敏度為98.2%，特異性為95.3%，均明顯高于細菌培養(yǎng)法的85.6%與86.6%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論PCR法較細菌培養(yǎng)法對細菌性陰道炎具有更好的診斷價值，值得臨床推廣應(yīng)用。

細菌培養(yǎng)；PCR；陰道細菌；檢驗

細菌性陰道炎為育齡婦女常見的臨床疾病，患者以生殖道微生物菌群變遷為基本特征[1]，起病緩慢，患者多無自覺癥狀，有臨床癥狀時往往感染較重，可導(dǎo)致盆腔及腹部感染，甚至可能導(dǎo)致患者喪失生育能力[2]。早期診斷、早期治療為獲得滿意預(yù)后的關(guān)鍵所在。目前臨床常用的檢測細菌性陰道炎的方法包括陰道分泌物檢查、分離培養(yǎng)法、PCR法、免疫熒光法等[3-5]。本研究為探討細菌性陰道炎有效的臨床檢測方法，選擇我院2012年10月至2014年10月收治的208例患者，于陰道后穹窿采集陰道分泌物后同時采用PCR法檢測陰道菌群，與細菌培養(yǎng)法檢測相關(guān)的致病菌相比較，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院收治的300例有外陰瘙癢、陰道分泌物增多、異味、陰道炎患者為研究對象，300例患者經(jīng)培養(yǎng)法檢查排除真菌性陰道炎患者，共計208例細菌性陰道炎患者。符合《婦產(chǎn)科學(xué)》中關(guān)于細菌性陰道炎的診斷標準，即：(1)陰道分泌物呈灰白色、黏稠、面糊狀，均勻一致；(2)分泌物呈魚腥味，性交時或活動后加重；(3)陰道分泌物的濕涂片中可檢出經(jīng)線索細胞；(4)陰道分泌物中的pH值增高，pH范圍5.0～5.5。上述四項中，具備三項以上者即可確診。患者年齡20～42歲，平均(32.6±3.9)歲。采用無菌棉簽于陰道后穹窿處蘸取陰道分泌物，置于無菌鹽水中保存，分別用細菌培養(yǎng)法及PCR法檢測細菌類別。

1.2 儀器與試劑 血瓊脂平皿、巧克力平皿、中國藍平皿、陰道加德納菌專用分離培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司，標準金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)均購自衛(wèi)生部生物制品鑒定所。全自動微生物鑒定儀為西門子診斷公司的MicroScan Walk Away96型。PCR儀為BioRad CFX96型，PCR所用試劑購自康為試劑有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 細菌培養(yǎng)法 取陰道分泌物在固體瓊脂平板、斜面培養(yǎng)基、半固體瓊脂培養(yǎng)基上行連續(xù)平行分區(qū)劃線法、連續(xù)蛇形劃線法、穿刺法接種，接種后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待長出菌落后置于全自動微生物鑒定儀鑒定細菌種類。

1.3.2 PCR法 將含1 000μl混有生理鹽水的陰道分泌物于1 200 r/min，離心15 min。離心后棄去上清液，向沉淀中加入組織裂解液，置于60℃水浴鍋孵育10～15 min后取出，然后以1 200 r/min離心10 min，取上清液為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：雙蒸餾水53.5μl，10×反應(yīng)緩沖液10.0μl，4×dNTPs(各1.25mmol/L)16.0μl，DNA模板10.0μl，引物(引物設(shè)計參考文獻[6-8]，由上海博亞生物技術(shù)有限公司協(xié)助合成)。Taq聚合酶0.5μl，總體積100μl。加入反應(yīng)體系后置于PCR儀上，以反應(yīng)條件：94℃60 s，37℃60 s，72℃120 s，共25～30個循環(huán)，結(jié)束后采用瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。陽性對照與陰性對照除不加模板DNA外，其余同檢測組。

1.4 判定標準 細菌培養(yǎng)陽性標準：培養(yǎng)基上長出典型菌落，經(jīng)生化鑒定為目的菌落即為陽性[9]。PCR陽性標準：條帶寬度不超過1mm，邊緣整齊，條帶在預(yù)期的堿基大小范圍內(nèi)，背景上無藥斑(Smears)也無引物二聚體出現(xiàn)，出現(xiàn)預(yù)期堿基大小之外的其他條帶為人工假陽性[10]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測方法陽性率比較 細菌培養(yǎng)法檢出陽性136例，陽性率為65.4%。PCR檢出陽性170例，陽性率為81.7%。PCR檢出陽性率明顯高于細菌培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 兩種方法檢測陽性菌分布情況比較 細菌培養(yǎng)法檢出陰道加德納菌84例(61.8%)，淋球菌27例(19.9%)，腸球菌25例(18.3%)，陰道加德納菌比例顯著高于其他菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。PCR法檢出陰道加德納菌90例(52.9%)，棒狀桿菌44例(25.9%)，腸球菌36例(21.2%)，陰道加德納菌比例明顯高于其他菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 兩種檢測方法的靈敏度、特異性比較 PCR法靈敏度為98.2%，特異性為95.3%。細菌培養(yǎng)法靈敏度為85.6%，特異性為86.6%。PCR法檢測靈敏度、特異性均顯著高于細菌培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

健康生育期女性陰道中寄生多種細菌，包括共生菌與條件致病菌。臨床研究顯示[11-12]，導(dǎo)致女性發(fā)生陰道感染的常見致病菌群有葡萄球菌、陰道加德納菌、腸球菌、鏈球菌、腸桿菌科菌等。通常情況下正常菌群不會致病，妊娠時因內(nèi)分泌影響導(dǎo)致女性陰道pH值升高，易造成菌群失調(diào)，正常菌群可成為致病菌，且隨孕周延長，陰道抵抗力下降，易導(dǎo)致各種感染的發(fā)生[13]。早期檢測致病菌群對于細菌性陰道炎治療、預(yù)后意義重大。目前臨床常采用的輔助診斷方法包括：細菌培養(yǎng)法、PCR檢測特定基因表達情況從而輔助診斷細菌感染等。臨床醫(yī)師可通過患者主訴，婦科查體及實驗室輔助檢查診斷陰道細菌性感染。其中陰道分泌物檢測對陰道炎等婦科疾病患者臨床診斷價值重大，檢查結(jié)果的準確性與診斷、治療密切相關(guān)[14-15]。

細菌培養(yǎng)法為目前臨床最常用的檢測方法，曾作為細菌性陰道炎檢測的金標準。但由于該方法操作復(fù)雜，對實驗室要求高，且需3 d以上方可獲得結(jié)果，而逐漸被新的檢測技術(shù)PCR所取代。PCR技術(shù)是基于DNA的半保留復(fù)制的一種基因工程技術(shù)，對樣本量要求低，檢測靈敏度高、特異性好，可于當天獲得結(jié)果，給臨床早期診斷、早期治療提供了可能。通過對臨床常見的致病菌以通用引物進行PCR試驗，結(jié)合臨床癥狀、體征可于早期診斷細菌性陰道炎。對于有特殊培養(yǎng)要求的細菌，難以培養(yǎng)甚至無法用人工方法培養(yǎng)的細菌，PCR檢測提供了一種新的途徑與方法，從而減少普通培養(yǎng)陰性導(dǎo)致的漏診、誤診。

本組研究中比較了細菌培養(yǎng)法與PCR法檢測細菌性陰道炎中細菌分布情況，結(jié)果顯示，PCR法陽性率顯著高于細菌培養(yǎng)法，PCR細菌分布以陰道加德納菌為主，其次為棒狀桿菌、腸球菌。細菌培養(yǎng)法細菌分布也是以陰道加德納菌為主，其次為淋球菌、腸球菌。兩種檢測方法細菌分布均以陰道加德納菌為主，其余細菌分布稍有差異。PCR檢測靈敏度、特異性均優(yōu)于細菌培養(yǎng)法，提示其在細菌性陰道炎臨床診斷中具有重要價值。PCR法還可檢測陰道分泌物中陰道加德納菌濃度，通過陽性、陰性陰道加德納菌濃度比較，可確定陰道炎陰道加德納菌正常參考范圍，濃度高于此參考范圍可高度懷疑細菌性陰道炎感染，結(jié)合臨床癥狀、體征可做出早期診斷，從而利于迅速控制感染，促進患者康復(fù)。

綜上所述，PCR法檢測陽性率顯著高于細菌培養(yǎng)法，檢測的靈敏性、特異性也較細菌培養(yǎng)法高，基于此我們提出PCR法在臨床效果上較細菌培養(yǎng)法好，利于在臨床推廣應(yīng)用。

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2015-01-09)

鄧石雄。E-mail：shixiongd@163.com