微波輔助提取野壩子中總黃酮及其抑菌性能研究

李 麗，余 麗，彭先陳，明桂峰，趙紅梅

（1.保山學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，云南保山 678000；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)與信息工程學(xué)院，昆明 650201）

微波輔助提取野壩子中總黃酮及其抑菌性能研究

李 麗1，余 麗1，彭先陳1，明桂峰1，趙紅梅2

（1.保山學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，云南保山 678000；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)與信息工程學(xué)院，昆明 650201）

以云南野壩子的莖葉為原料，微波輔助法提取了野壩子中的總黃酮。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用正交試驗(yàn)法對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并與回流提取法進(jìn)行了比較；采用濾紙片法對野壩子總黃酮粗提液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌3種細(xì)菌進(jìn)行了初步抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶30 g／m L，微波功率為350W，微波時(shí)間為60 s時(shí)，提取效果最佳，總黃酮平均得率達(dá)2.98%，優(yōu)于回流法；粗提液對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌抑制效果較好，而對金黃色葡萄球菌無明顯抑制作用。

野壩子；總黃酮；微波

野壩子（Elsholtzia rugulosa）為唇形科植物，在云南民間，是一種廣為人知的藥食同源的植物，具有疏風(fēng)解表、利濕、消食化積的功效，在治療傷風(fēng)感冒、腸胃炎、痢疾以及外用止血、敷爛瘡和蛇咬傷等方面有較好的療效。研究表明［1－4］：野壩子中含有黃酮類、羧酸類、果酸類、芹菜素、酚類、苷類、醇類等化學(xué)成分。同時(shí)，野壩子中除含人體必需的多種微量元素外，還富含Cu、Zn、Fe、Mn、Se等元素。近年來，隨著人們對天然植物成分的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和重視，野壩子中的揮發(fā)油、黃酮類提取工藝也見報(bào)道［5－6］，但是，大多還處于傳統(tǒng)工藝階段，且存在工藝過于復(fù)雜，提取率不夠高等缺點(diǎn)。而且，作為一種傳統(tǒng)的民間中草藥，對其黃酮抗菌性能的研究報(bào)道還較為少見［2］。

微波輔助提取技術(shù)以其自身獨(dú)特的特點(diǎn)，在國內(nèi)外眾多植物成分提取研究中逐步凸顯優(yōu)勢，在全世界越來越注重環(huán)保問題的當(dāng)今，備受相關(guān)研究者的青睞［7－11］。本文采用微波輔助法提取了野壩子莖葉中的總黃酮，并對其抗菌性能進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，以期為野壩子莖葉資源的傳承、重視提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

野壩子采集于保山隆陽區(qū)，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌由保山學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，蘆丁（優(yōu)級(jí)純），亞硝酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉、乙醇均為分析純，蒸餾水。

恒溫振蕩培養(yǎng)箱（HZQ－XI00A），顯微鏡（Smart），移液槍（芬蘭百得），不銹鋼立式滅菌器（LDZX－75KB），電熱恒溫干燥培養(yǎng)箱（DHP－9082），旋風(fēng)式粉碎磨（杭州麥哲儀器有限公司），電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司），2XZ－1型旋轉(zhuǎn)式真空泵（南京真空泵廠），MW20－M605微波爐（廣東歐派集團(tuán)有限公司），722型光柵分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮的提取

取一定量的野壩子莖葉粉末，加一定量石油醚脫脂脫色2次。真空泵抽濾后自然揮干殘留的石油醚。然后，加入一定量的一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液，放入微波爐中進(jìn)行間歇式微波加熱一定時(shí)間，抽濾并用少量乙醇溶液洗滌濾渣，取濾液，并用乙醇溶液定容至50 mL容量瓶中，得野壩子總黃酮的樣品液，避光保存。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)［12］，以質(zhì)量濃度ρ（g／L）對吸光度A回歸，得回歸方程：A＝8.95058ρ＋0.02036，R2＝0.9994。

1.2.3 總黃酮含量的測定

準(zhǔn)精確移黃酮提取液取4.00mL，加入25 mL比色管中，按1.2.2方法測定吸光度，對照回歸方程得到野壩子莖葉總黃酮濃度，然后計(jì)算出野壩子莖葉總黃酮含量。

黃酮得率＝（提取液中黃酮含量／樣品質(zhì)量）×100%

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 料液比對黃酮提取率的影響

選擇料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g／mL，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，微波功率為350W、提取時(shí)間為60 s，考察料液比對野壩子莖葉黃酮提取率的影響。

1.2.4.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響

分別選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，固定料液比為1∶30 g／m L，微波功率為350 W、提取時(shí)間為60 s，考察乙醇對野壩子莖葉黃酮提取率的影響。1.2.4.3 微波功率對黃酮提取率的影響

分別選擇微波功率為70、210、350、490、700 W，固定料液比為1∶30 g／mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取時(shí)間為60 s，考察微波功率對野壩子莖葉黃酮提取率的影響。

1.2.4.4 提取時(shí)間對黃酮提取率的影響

分別選擇提取時(shí)間40、60、80、100、120s，固定料液比為1∶30 g／m L，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、微波功率為350W，考察提取時(shí)間對野壩子莖葉黃酮提取率的影響。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平表Tab.1 The factors and levels of orthogonal experiment

在單因素的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了各因素的相互影響情況，并得出最佳提取工藝條件。選擇表1中4個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果的較優(yōu)水平，按L9（34）設(shè)計(jì)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

1.4 抑菌性試驗(yàn)

取最佳工藝的野壩子莖葉黃酮粗提液采用濾紙片法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)［13－14］。試驗(yàn)過程參考文獻(xiàn)［15］。分別對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌3種細(xì)菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測量細(xì)菌周圍明顯的抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 野壩子莖葉黃酮提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對野壩子莖葉黃酮得率的影響

料液比對野壩子莖葉總黃酮提取的影響見圖1。

圖1 料液比對野壩子莖葉總黃酮得率的影響Fig.1 The effect of solid／liquid ratio on extraction rate of total flavones

由圖1看出：隨著料液比的增加，黃酮得率先增后減，1∶30 g／m L時(shí)達(dá)最大值。原因可能是：當(dāng)料液比較小時(shí)，對黃酮類物質(zhì)充分溶出不利；當(dāng)料液比較大時(shí)，溶劑對微波能消耗過大，原料所吸收的微波能相對減少，不利于黃酮的提取。因此，試驗(yàn)中選取料液比為1∶30 g／m L。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對野壩子莖葉黃酮總黃酮得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對野壩子莖葉總黃酮提取的影響見圖2所示。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對野壩子莖葉黃酮總黃酮得率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavones

由圖2看出：隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，總黃酮的得率先緩慢增加，然后迅速下降，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)達(dá)最大值。這可能是因?yàn)椋?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，水溶性物質(zhì)溶出較多，對黃酮的提取不利，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過大時(shí)，色素、脂類等物質(zhì)的溶解能力增強(qiáng)，黃酮類物質(zhì)的溶解能力降低。因此，選乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.1.3 微波功率對野壩子莖葉總黃酮得率的影響

微波功率對野壩子莖葉總黃酮提取的影響見圖3所示。

由圖3看出：總黃酮的得率隨微波功率的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)功率達(dá)350W時(shí)達(dá)最大值。這可能是適當(dāng)?shù)奈⒉üβ剩訜嵝Ч茫肿舆\(yùn)動(dòng)加劇，溶出的總黃酮增多，因此，試驗(yàn)中選微波功率為350W。

2.1.4 提取時(shí)間對野壩子莖葉總黃酮得率的影響

提取時(shí)間對野壩子莖葉總黃酮提取的影響見圖4所示。

圖3 微波功率對野壩子莖葉總黃酮得率的影響Fig.3 The effect of microwave power on extraction rate of total flavones

圖4 提取時(shí)間對野壩子莖葉總黃酮得率的影響Fig.4 The effect of irradiation time on extraction rate of total flavones

由圖4看出：隨著提取時(shí)間增加，總黃酮得率隨著提取時(shí)間的增加而增大，60 s時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)提取時(shí)間大于60 s后，總黃酮得率反而下降。其可能原因與2.1.3原因類似，所以，試驗(yàn)中選提取時(shí)間為60 s。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

續(xù)表

由表2看出，對野壩子莖葉總黃酮得率的影響大小依次為：料液比（B）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞微波功率（C）＞提取時(shí)間（D）。微波輔助提取的優(yōu)化工藝條件是A2B2C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶30 g／mL，微波功率為350W，提取時(shí)間為60 s。按此工藝條件下進(jìn)行了3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總黃酮得率分別為2.99%，2.96%和2.98%，平均2.98%。

2.3 對比實(shí)驗(yàn)

表3為微波輔助提取與回流提取野壩子中的黃酮的對比實(shí)驗(yàn)。

表3 微波輔助提取與回流提取的比較Tab.3 Comparison of microwave extraction with the Reflux extraction

由表3可見，在其他條件相同的情況下，與傳統(tǒng)回流提取法相比，微波輔助法不僅省時(shí)，并且高效，因此，微波輔助法在黃酮的提取中，具有較好的優(yōu)勢。

2.4 抑菌性試驗(yàn)結(jié)果

野壩子黃酮粗提液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑見表4。由表4看出，野壩子黃酮粗提液對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制作用較強(qiáng)，而對金黃色葡萄球菌沒有明顯的抑制效果。

表4 黃酮抑菌圈直徑Tab.4 The diameter of antibacterial circle

3 結(jié)論

1）采用單因素試驗(yàn)及正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)相結(jié)合，對微波輔助提取野壩子莖葉總黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶30 g／mL，微波功率為350W，提取時(shí)間為60 s時(shí)，總黃酮得率最佳，達(dá)2.98%。

2）與傳統(tǒng)回流法相比，微波輔助提取法具有高效及低能耗的優(yōu)勢，在注重環(huán)境友好的今天，是一種理想的提取植物黃酮的技術(shù)。

3）野壩子黃酮粗提液對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制作用較強(qiáng)，而對金黃色葡萄球菌沒有明顯的抑制效果。

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Study on Microwave－assiste Extraction and Anti－microbial Activities of Total Flavones from the Leaves of Elsholtzia rugulosa

LI Li1，YU Li1，PENG Xian－chen1，M ING Gui－feng1，ZHAO Hong－mei2

（1.Department of Resource and Environment Baoshan College，Baoshan 678000，China；
2.College of Basic Science and Information Engineering，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）

Microwave－assiste technology was used to extract total flavonoids from Elsholtzia rugulosa.The influences on this assay strategy were carefully optimized by single factor test and orthogonal design test of L9（34），and then Compared with the Reflux extraction.Meanwhile，the bacteriostatic testof resulting extractwas further emulated to escherichia coli，bacillusand saphyloccocus aureus.The resulted indicated thatwhen the ethanol was 70%（wt%），solid－1iquid ratio was 1∶30g／mL，extracting time was 60s，and microwave power was 350W，the optimal amount of total flavonoids was 2.81%better then the Reflux extraction.In addition，the extract has obvious antibacterial effect to escherichia coli and bacillus，but has no obvious effect to saphyloccocus aureus.

Elsholtzia rugulosa；total flavonoids；microwave－assiste

TQ35

A

1004-275X（2015）06-0011-05

收稿：2015-10-19

保山學(xué)院科研教研基金重點(diǎn)項(xiàng)目（13BZ012）。

李麗（1982－），女，云南昌寧人，碩士，講師，研究方向?yàn)榇呋瘜W(xué)。

趙紅梅（1983－），女，云南紅河人，碩士，講師，主要從事多孔功能材料制備和催化研究方向。E－mail：zhaohongmei017＠126.com

10.3969／j.issn.1004-275X.2015.06.003