一株抗菌活性物質產生細菌的分離及鑒定

殷杰+王蒙+曾小波+馬志勇+程國軍

摘要：從根際土壤分離到一株細菌CY04，通過電鏡觀察和16S rDNA 序列分析，發現該菌株同已知菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的相似度最高，為99%， 初步認定為枯草芽孢桿菌。抑菌試驗結果表明，該菌株對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有一定的抑菌活性，對大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌沒有抑菌活性。培養48 h左右是其產生抗菌活性物質的最佳時期。

關鍵詞：根際土壤;枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;鑒定;抑菌活性

中圖分類號：Q936 ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）02-0346-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.022

Isolation and Identification of One Strain Producing Antimicrobial Active Substance

YIN Jie，WANG MENG，ZENG Xiao-bo，MA Zhi-yong，CHENG Guo-jun

（College of Life Science， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074， China）

Abstract：A bacterium strain， designated as CY04， was isolated from the rhizosphere soil. The strain CY04 had the highest sequence identity with Bacillus subtilis （99%）. Based on morphological characteristics and analysis of the 16S rDNA sequence， ?the strain CY04 was identified as Bacillus subtilis. The antagonistic effects showed that CY04 had antimicrobial activity on Staphylococcus aureus， but had little inhibition on Escherichia coli and Bacillus subtilis. The optimal time for the resistant bacteria to produce antimicrobial active substance was 48h after cultivation.

Key words： rhizosphere soil;Bacillus subtilis;identification;antimicrobial activity

隨著有害生物耐藥性問題的加劇，微生物產生的活性成分物質在人類疾病防治、動物醫藥保健、植物抗病害及食品防腐等方面表現出巨大的應用潛力。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）通過產生多種抗菌代謝產物，能有效抑制病原菌并促進動植物生長，具有較高的工業、農業以及醫藥應用價值[1]，同時，枯草芽孢桿菌也被認為是潛在的益生菌[2]。

目前已知枯草芽孢桿菌可以產生多種抗菌物質，包括細菌素、脂肽類抗生素以及酶類、蛋白類抑菌物質等[3]。從枯草芽孢桿菌中分離的Fengycin能夠抑制多種重要植物病原真菌的生長[4]。本研究從根際土壤樣品中分離到一株能產生抗菌物質的細菌CY04，并根據形態學特征和16S rDNA基因序列對其進行了鑒定，初步認定其為枯草芽孢桿菌，同時對它的拮抗情況及產生原因進行了探討。

1 ?材料與方法

1.1 ?抗菌活性物質產生菌種的篩選

在帶有玻璃珠的三角瓶中加入根際土樣1 g和99 mL蒸餾水，放置于28 ℃搖床內振蕩30 min，取樣做梯度稀釋后，用其涂布牛肉膏蛋白胨平板，置于37 ℃生化培養箱中培養48 h，從中分離出細菌單株;以金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為檢測菌，采用紙片法進行菌株篩選，并對產生活性物質進行驗證試驗。

1.2 ?CY04細菌的個體形態和電鏡觀察

在LB平板上觀察菌落形態，利用革蘭氏染色法在油鏡下觀察菌體形態。將菌株用戊二醛固定，PBS洗滌和梯度乙醇脫水，真空冷凍干燥機干燥，掃描電鏡觀察、拍照。電鏡放大倍數15 000。

1.3 ?CY04細菌16S rDNA基因序列測定和系統進化分析

用LB培養基搖床培養菌體至對數期，離心后收集菌體，抽提細菌基因組的總DNA。以CY04菌株基因組DNA為模板擴增16S rDNA基因片段[5]。擴增引物選用細菌通用PCR引物16S-F（5′AAGGAGGTGATCCAGCC3′）、16S-R（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）。擴增程序為，94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30次循環;72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠回收，克隆到pMD18-T載體[寶生物工程 （大連）有限公司]，經酶切和PCR驗證后，送北京擎科新業生物技術有限公司測序。序列提交GenBank數據庫進行同源性比較分析。采用Bioedit和MAGE 4.0軟件以鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹[6]。endprint

1.4 ?菌株CY04對不同指示菌拮抗能力的測定

以大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌為指示菌，采用牛津杯（內徑6 mm，外徑8 mm）法測定菌株CY04對不同指示菌拮抗能力[7]。取已活化的指示菌菌液接入牛肉膏蛋白胨液體培養基，37 ℃、20 r/min培養24 h。倒牛肉膏蛋白胨平板，在每個平板的中央置一個已滅菌的牛津杯，吸取指示菌菌懸液在平板上均勻涂布，待平板晾干后進行抑菌試驗。將CY04菌株培養液離心，取上清液加入到牛津杯中，37 ℃恒溫培養箱中培養48 h，觀察生長情況并測量抑菌圈直徑。

將活化后的菌株CY04按2%的接種量接入牛肉膏蛋白胨培養液中，每隔6 h取菌液離心，將上清液加入到牛津杯中，測定其對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑，確定產生活性物質的最佳時期。

1.5 ?菌株CY04的抗性測定

以抗生素卡那霉素（Km）、氨芐青霉素（Ap）、鏈霉素（Str）、四環素（Tc）、慶大霉素（Gm）、氯霉素（Cm）、壯觀霉素（Spe）為抗生活性物質，測定菌株CY04對抗生活性物質的抗性。將菌株CY04接種到LB培養液中，37 ℃搖床培養過夜。按2%的接種量將菌株接種于含不同濃度抗生素的LB液體培養基中，37 ℃搖床（200 r/min）振蕩培養48 h，測定含各種不同濃度抗生活性物質菌液的吸光度，分析菌株CY04生長情況。

2 ?結果與分析

2.1 ?菌株CY04篩選及形態觀察

進行細菌單株分離、篩選試驗發現菌株CY04對金黃色葡萄球菌有較強的拮抗作用。菌株CY04革蘭氏染色為陽性，產芽孢，其形態特征見圖1。細菌大小為0.3～0.5 μm×1.5～3.0 μm。

2.2 ?菌株CY04的16S rDNA測序結果

以菌株CY04的DNA為模板進行擴增，獲得1.5 kb左右的特異性片段，將測序結果和GenBank已登錄的序列進行同源性比對，發現與Bacillus中多個種的序列具有高度同源性;與Bacillus subtilis同源性最高，達到99%。

2.3 ?菌株CY04的系統進化樹

選取同源性較高的菌株，以菌株CY04的16S rDNA序列用MEGA軟件的Neighbor-Joining法構建系統進化樹（圖2）。從系統進化樹可以看出菌株CY04與Bacillus subtilis細菌遺傳距離最近，相似度達到99%，而與Bacillus licheniformis距離相對較遠。依據形態學和同源性比對結果，判斷所分離的活性物質產生菌株CY04為Bacillus subtilis。在系統發育地位上屬于Bacteria界Firmicutes門 Bacilli綱Bacillales目Bacillaceae科 Bacillus屬Bacillus subtilis種。

2.3 ?菌株CY04的抑菌活性

采用牛津杯法對菌株CY04的抑菌譜試驗結果（圖3）表明，對革蘭氏陰性菌大腸桿菌沒有抑制作用，對革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌也沒有抑制作用，對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用，其抑菌圈達到14.2 mm。說明菌株CY04分泌的活性物質主要針對革蘭氏陽性菌的某些類群，具有較強的特異性。菌株CY04對革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌沒有拮抗作用，可能是因為CY04為芽孢桿菌，其產物不會對同類型菌株產生傷害。

2.4 ?菌株CY04代謝活性物質產生時期的測定

每隔6 h取樣進行抑菌圈測定發現，培養48 h左右培養液產生的抑菌圈最大，進而可以推斷菌株CY04在48 h左右產生的活性物質最多，其產生活性物質的時間在其生長穩定后期，這與已有的報道一致[1]。

2.5 ?菌株CY04的抗性

菌株CY04的抗性的檢測結果（表1）表明，除壯觀霉素對菌株CY04的最小抑菌濃度達到20 μg/mL外，其他抗生素的最小抑菌濃度均較低，說明菌株CY04對其他抗生活性物質的抗性均較低。一般具有活性物質抗性的細菌在環境中與土著微生物競爭具有一定優勢，CY04菌株較低的活性物質抗性，不利于其在環境中生存。CY04菌株自身產生具有拮抗作用的抗生活性物質，是一種有效防衛機制，使其在種間競爭中戰勝其他微生物保存自己。

3 ?小結與討論

微生物殺菌劑具有高效、無污染、不易產生抗藥性等特點，因而有廣闊的應用前景。枯草芽孢桿菌產生抗菌活性物質已有相關報道[8-10]。本研究從根際土壤中分離到的細菌菌株CY04根據形態學特征以及16S rDNA序列比較鑒定為枯草芽孢桿菌。菌株CY04對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌沒有抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑制作用較明顯，說明CY04產生的抗生活性物質具有選擇性毒力。進一步研究發現，CY04對除壯觀霉素外的其他幾種抗生素的抗性均較低，表明CY04菌株產生抗菌物質，是其能夠在環境中生存的有效防衛機制。

參考文獻

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