響應(yīng)面法對(duì)超聲波提取藤茶二氫楊梅素工藝的優(yōu)化

梁琍 邱嵐 張良

摘要：通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)超聲波提取梵凈山野生藤茶（Ampelopsis grossedentata）二氫楊酶素的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間為影響因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以二氫楊酶素提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化超聲提取梵凈山野生藤茶中二氫楊梅素的條件。結(jié)果表明，超聲波提取藤茶中二氫楊梅素最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)51.00%、料液比1∶26.00（g∶mL）、超聲波時(shí)間40.00 min，在此條件下二氫楊梅素的提取率為28.41%，回歸模型預(yù)測(cè)的二氫楊梅素提取率為28.61%，經(jīng)驗(yàn)證RSD為1.16%，擬合度較好，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取藤茶二氫楊梅素的工藝條件穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：藤茶（Ampelopsis grossedentata）;二氫楊梅素;超聲波提取;響應(yīng)面分析法

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.5+3;R284.2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）02-0416-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.040

Optimizing Ultrasonic-assisted Extraction of Dihydromyricetin from the Wild Ampelopsis grossedentata in Fanjing Mountain with Response Surface Method

LIANG Li，QIU Lan，ZHANG Liang

（Department of Biological and Chemical Engineering， Tongren University/Research Center for Conservation and Utilization of Wildlife Resources in Fanjing Mountain/Key Laboratory of Special Wildlife Resources in Fanjing Mountain， Tongren 554300， Guizhou，China）

Abstract： Response Surface Method was used to optimize the extraction of dihydromyricetin from the wild Ampelopsis grossedentata with ultrasonic wave. The concentration of alcohol， the ratio of solid to liquid and ultrasonic time were selected on the basis of single factor experiment with 3 factors and 3 levels of Box-Behnken center combination experimental design. The extraction rate was used as response value for response surface analysis. The conditions of dihydromyricetin ultrasonic-assisted extraction were optimized. The results showed that the optimal conditions were alcohol concentration 51.00%， ratio of solid to liquid 1∶26 g/mL， extraction time 40.00 min. Under these conditions， the extraction rate of dihydromyricetin was 28.41%. The predicted extraction rate of dihydromyricetin was 28.61%. Through verification test， the relative standard deviation was 1.16% and fit well. It is indicated that the optimized process was stable and feasible.

Key words： Ampelopsis grossedentata; dihydromyricetin; ultrasonic extraction; response surface analysis method

藤茶屬葡萄科（Vitaceae）蛇葡萄屬（Ampelopsis），學(xué)名為顯齒蛇葡萄 （Ampelopsis grossedentata）， 俗稱(chēng)甜樹(shù)茶、甜茶藤等，是一種多年生的藤本植物，生長(zhǎng)在海拔400～1 300 m的山坡、林中、河灘等陰濕和肥沃的土壤中，是一種典型的藥食兩用植物[1]。藤茶中含有多種化學(xué)成分，包括水分、蛋白質(zhì)、維生素、多酚和黃酮等，其中黃酮類(lèi)化合物具有最重要的藥理作用，而二氫楊梅素是其中最重要的黃酮類(lèi)化合物，藤茶系目前國(guó)內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的二氫黃酮類(lèi)化合物中含量最高的植物[2]，經(jīng)試驗(yàn)證明，二氫楊梅素具有抗氧化、鎮(zhèn)痛、止咳、廣普抑菌、保肝護(hù)肝、降血糖、降血脂、增強(qiáng)人體免疫力以及抑制腫瘤等多種功效[3]，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

梵凈山位于貴州省東北部江口、印江和松桃3縣交界之處，總面積567 km2，主峰鳳凰山海拔2 572 m，是武陵山系最高的山體，是一個(gè)以珍稀植物和動(dòng)物為主的國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。1986年被聯(lián)合國(guó)教科文組織批準(zhǔn)接納為世界“人與生物圈”保護(hù)區(qū)網(wǎng)的成員[4]。該保護(hù)區(qū)植被類(lèi)型多樣，主要有針葉林、闊葉林、竹林、灌叢、沼澤5個(gè)類(lèi)型[5]，植物資源極為豐富，達(dá)1 800種[4]，是非常寶貴的藥用植物資源庫(kù)。目前關(guān)于梵凈山野生藤茶二氫楊梅素的提取尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以梵凈山野生藤茶為原料，在超聲波輔助提取藤茶中二氫楊梅素的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，為開(kāi)發(fā)梵凈山野生藤茶及其綜合利用提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與儀器

試驗(yàn)所用藤茶采自梵凈山，將藤茶在60 ℃下烘干，經(jīng)高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，將其裝于干燥試劑瓶，貼上標(biāo)簽作為待測(cè)樣品。

主要試劑：二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司）;95%乙醇[分析純，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司];無(wú)水三氯化鋁（天津市博迪化工有限公司）等。

主要儀器：GUTEL超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）;101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）;FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）;KQ-C型玻璃儀器氣流烘干器（鞏義市予華有限責(zé)任公司）;電子分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）;SHZ-DIII予華牌循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）;T6型新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）等。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 ?準(zhǔn)確稱(chēng)取二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品5.2 mg，用95%的乙醇定容到50 mL容量瓶中揺均，分別吸取溶液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL置10 mL容量瓶中，精確加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的AlCl3溶液3 mL，用95%的乙醇溶液定容到10 mL，揺均后放置40 min，在315 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[6]，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到的回歸方程為：A=78.686x+0.006 7，R2=0.998 9（n=5）。

1.2.2 ?藤茶中二氫楊梅素含量的測(cè)定 ?準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g藤茶粉末放入錐形瓶中，按1∶20（g∶mL，下同）的料液比加入50%的乙醇浸泡10 min，放入超聲波功率80 W處理40 min吸取提取液抽濾。將趁熱抽濾的提取液裝于大試管中，抽取0.1 mL于10 mL的容量瓶中，用95%的乙醇定容至刻度搖勻，抽取1 mL于另外的10 mL容量瓶中，加入5%的AlCl3 3 mL，用95%的乙醇定容至刻度揺勻，同時(shí)做空白液對(duì)照，在室溫下放置40 min，于分光光度計(jì)中測(cè)定吸光度[7]，其提取率的計(jì)算公式為：

二氫楊梅素的提取率=（A-0.006 7）×V×P×K/1 000×G×78.686×100%

式中，A為提取液的吸光度;V為提取液的體積（mL）;P為稀釋倍數(shù)（P=1 000倍）;G為藤茶的質(zhì)量（g）;K為二氫楊梅素在總黃酮中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（K=0.86）[8]。

1.2.3 ?單因素試驗(yàn) ?設(shè)置單因素試驗(yàn)分別考察超聲波提取二氫楊梅素時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間對(duì)二氫楊梅素提取率的影響。①乙醇體積分?jǐn)?shù)。室溫（20 ℃）下放置10 min、料液比1∶20、超聲時(shí)間40 min、超聲波功率80 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別取30%、40%、50%、60%、70%、80%。②料液比。室溫（20 ℃）下放置10 min、超聲波時(shí)間40 min、超聲波功率80 W，料液比分別取1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。③提取時(shí)間。室溫（20 ℃）下放置10 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲波功率80 W，提取時(shí)間分別為20、30、40、50、60、70 min。

1.2.4 ?響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) ?根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert.V8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲波時(shí)間（B）、料液比（C）為自變量，二氫楊梅素提取率（Y）為響應(yīng)值[9-12]，做3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的二次回歸正交組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)。利用Microsoft Office Excel 2007、Originpro7.5、Design-Expert.V8.0軟件來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 ?乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)二氫楊梅素提取率的影響 ?由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取率逐漸增加。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%的時(shí)候提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，二氫楊梅素的提取率又呈下降趨勢(shì)，出現(xiàn)這種情況的原因是因?yàn)槎錀蠲匪貫闃O性化合物，根據(jù)相似相容的原理，當(dāng)溶劑體系的極性與二氫楊梅素的極性相當(dāng)時(shí)，二氫楊梅素的提取率達(dá)到最佳。從圖2中可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，溶劑體系的極性與二氫楊梅素的極性相當(dāng)，所以這時(shí)候的提取率達(dá)到最大，因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)最佳。

2.1.2 ?提取時(shí)間對(duì)二氫楊梅素提取率的影響 ?由圖3可以看出，由于二氫楊梅素?zé)岱€(wěn)定性相對(duì)較好，在較短的時(shí)間內(nèi)，其結(jié)構(gòu)不會(huì)發(fā)生太大的變化，在其他條件恒定時(shí)，二氫楊梅素的一般提取率的超聲波提取時(shí)間為20～50 min，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)提取率呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲波提取時(shí)間為40 min時(shí)，二氫楊梅素的提取率達(dá)到最大，因此40 min為最佳的提取時(shí)間。

2.1.3 ?料液比對(duì)二氫楊梅素提取率的影響 ?一般情況下，隨著溶劑的增加，可以使細(xì)胞壁內(nèi)外濃度差增大，有利于有效成分的溶出，提取效果就越好。從圖4可以看出，料液比在1∶10～1∶25之間時(shí)，隨著溶劑的增加，二氫楊梅素提取率逐漸增大，在1∶25時(shí)達(dá)到最大，之后隨著溶劑的增加，二氫楊梅素的提取率反而緩慢的下降，因此確定料液比為1∶25最為合適。

2.2 ?響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定響應(yīng)面各因素及水平如表1所示。采用Design-Expert軟件，選用Box-Behnken模型，以野生藤茶中二氫楊梅素提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。通過(guò)Design-expert.V8.0軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，以A、B、C為自變量對(duì)提取率Y進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合建立如下多元二次回歸數(shù)學(xué)模型：Y=28.17+1.72A+1.08B+1.79C-0.095AB+0.24AC-1.36BC-6.14A2-3.44B2-2.87C2

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)藤茶中二氫楊梅素提取的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，此模型F值為28.93，P=0.000 1，該模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.084 9>0.05），說(shuō)明建立的模型與實(shí)際有較好的擬合度。該方程的回歸決定系數(shù)為0.973 8，說(shuō)明有97.38%的響應(yīng)值符合此模型，校正決定系數(shù)為0.940 2，說(shuō)明有94.02%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用此回歸模型來(lái)解釋?zhuān)渲凶儺愊禂?shù)為5.08%、精密度為14.365%，說(shuō)明此方程具有良好的穩(wěn)定性和精密度[13]。綜上所述，該模型能較好地?cái)M合實(shí)際超聲波提取藤茶中的二氫楊梅素。

為了更直觀地表現(xiàn)兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)藤茶中二氫楊梅素提取率的影響，通過(guò)Design-Expert.V8.0對(duì)試驗(yàn)因素A、B、C以任意一項(xiàng)為固定值對(duì)其余兩項(xiàng)進(jìn)行響應(yīng)面分析和作圖[14]，以考察各交互項(xiàng)對(duì)藤茶中二氫楊梅素提取率的的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6和圖7。

由圖5（a）可知，當(dāng)料液比確定為最佳值1∶25時(shí)、乙醇體積分?jǐn)?shù)不變，可知提取時(shí)間響應(yīng)面曲線圖比較平緩，在料液比為1∶25、提取時(shí)間不變時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取率先增大后減小，說(shuō)明在此條件下乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)響應(yīng)值的影響比較大。從圖5（b）可知，提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高線呈圓形，說(shuō)明提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)超聲波提取藤茶中二氫楊梅的交互作用不顯著。

由圖6（a）可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)確定為最佳值50%時(shí)，提取時(shí)間不變，隨著料液比的增加，提取率先增大后緩慢降低，當(dāng)料液比不變時(shí)，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率也緩慢降低，說(shuō)明在此條件下提取時(shí)間和料液比響應(yīng)面曲線呈先增大后減小的趨勢(shì)，說(shuō)明兩者增加對(duì)二氫楊梅素的提取率影響效果明顯。從圖6（b）可知，提取時(shí)間和料液比的等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明提取時(shí)間和料液比對(duì)超聲波提取藤茶中二氫楊梅素的交互作用顯著。

由圖7（a）可知，當(dāng)提取時(shí)間確定為最佳值40 min時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)不變時(shí)，料液比響應(yīng)面比較平緩，說(shuō)明在此條件下料液比對(duì)二氫楊梅素提取率影響效果不明顯，當(dāng)料液比不變時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大提取率先增大后減小，說(shuō)明此條件下乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)二氫楊梅素提取率影響效果明顯，從圖7（b）可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的等高線呈圓形，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)超聲波提取藤茶中二氫楊梅素的交互作用不顯著。

綜合分析響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果可知，考慮各因素交互作用可知AB、AC交互作用不明顯即乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比交互作用不明顯，BC交互作用明顯即提取時(shí)間與料液比交互作用明顯。

通過(guò)Design-Expert.V8.0對(duì)二元回歸方程求最大值[15，16]，得最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)51.45%、料液比1∶26.48、提取時(shí)間為40.96 min，提取率為28.61%。根據(jù)實(shí)際情況選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為51.00%、料液比為1∶26.00、提取時(shí)間為40.00 min，在此條件下重復(fù)試驗(yàn)5次測(cè)得二氫楊梅素的實(shí)際提取率為28.41%，接近理論提取率，RSD為1.16%，說(shuō)明響應(yīng)面法建立的藤茶二氫楊梅素提取數(shù)學(xué)模型具有穩(wěn)定可靠性，試驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好。

3 ?小結(jié)

以梵凈山野生藤茶為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)，分析了乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波提取時(shí)間、料液比對(duì)野生藤茶中二氫楊梅素提取率的影響。用Design-Expert.V8.0軟件中的Box-Benhnken（BBD）中心組合原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，建立了以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比為自變量，以野生藤茶二氫楊梅素提取率為響應(yīng)值的多元二次回歸數(shù)學(xué)模型，得出超聲波輔助提取梵凈山野生藤茶中二氫楊梅素的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)51.00%、超聲波時(shí)間40.00 min、料液比1∶26.00，在此條件下實(shí)際提取率為28.41%，與Design-Expert.V8.0分析預(yù)測(cè)值相差較小，RSD為1.16%，因此認(rèn)為經(jīng)優(yōu)化后的提取條件合理可行。梵凈山野生藤茶中二氫楊梅素具有一定的抗氧化、免疫、降血脂、降血糖等保健作用。因此，野生藤茶中二氫楊梅素在食品和醫(yī)藥工業(yè)中，具有廣泛的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

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