農桿菌介導phyA基因轉化玉米愈傷組織培養體系的優化

徐丹丹 王丕武 趙邯鄲 劉雙 陳昭汀 關淑艷

摘要：以根癌農桿菌（Agrobacterium）EHA105介導外源基因phyA轉入玉米（Zea mays L.）自交系GS01的胚性愈傷組織， 并利用除草劑（草胺磷）篩選出抗性愈傷組織，培養并獲得再生植株。結果表明，菌液濃度及侵染時間顯著影響愈傷組織的轉化率;不同激素種類及配比對抗性愈傷組織再生植株的影響明顯。當菌液濃度OD600 nm為0.6，侵染時間為20 min時，抗性愈傷組織的轉化率最高，達到了68.7%，為玉米農桿菌轉化并獲得再生植株奠定了基礎。

關鍵詞：農桿菌（Agrobacterium）;玉米（Zea mays L.）自交系;遺傳轉化;phyA基因

中圖分類號：S513.032 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）02-0465-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.054

Optimizing Conditions of Transforming phyA Gene into Maize with Agrobacterium

XU Dan-dana，WANG Pi-wub，ZHAO Han-dana，LIU Shuanga，CHENG Zhao-tinga，GUAN Shu-yana

（a.College of Life Sciences;b. College of Agronomy，Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）

Abstract： Foreign gene phyA was transfered to embryonic callus of maize inbred lines GS01 with Agrobacterium EHA105-mediated. Herbicides （alachlor P） were used to screen resistant callus and regenerate plantlets. The results showed that bacteria concentration and infection time affected callus conversion rate significantly. Types of hormone and proportion affected obviously regeneration plantlet of resistant callus. Bacteria concentration was 0.6 at OD600 nm. Infection time was 20 min. Resistant callus rate was high with 68.7%. It will provide a good reference for the regeneration and transformation of maize mediated by Agrobacterium.

Key words： Agrobacterium; maize inbred lines; genetic transformation; phyA gene

玉米（Zea mays L.）是糧食作物中重要的工業原料，在全世界糧食生產中占有舉足輕重的地位[1-3]。2010年，我國玉米種植面積達到了324萬hm2，成為世界第二大玉米生產國，而玉米也成為了我國的“谷物之王”[4]。玉米在我國經濟生產中占有重要地位，因此大力提高玉米的產量及品質，成為了眾多學者積極探尋的問題[5-7]。植酸酶能有效地水解食物以及土壤中植酸態有機磷，釋放出生命體可以直接吸收利用的無機磷酸及其鐵、鈣、鋅、鎂等鹽類，有效地提高了其生物利用率。因此，植酸酶基因克隆及導入受體組織并獲得可再生植株對研制植酸酶食品或飼料添加劑、開發高級保健食品和優質飼料、循環利用土壤中有機磷、緩解全球性磷礦產資源危機等具有重要意義[8-13]。本研究以玉米自交系GS01的胚性愈傷組織為材料，將連有根部特異性啟動子和植酸酶基因phyA的載體轉入玉米自交系中，對影響農桿菌介導的玉米遺傳轉化的因素進行探討，從而確定了農桿菌介導轉化的最佳菌液濃度及最佳侵染時間，優化了農桿菌介導玉米遺傳轉化條件，并成功獲得玉米抗性苗，為基因工程育種打下了基礎，為獲得含有phyA基因的轉基因玉米植株提供了條件，同時為進一步提高玉米的產量及品質的研究奠定了基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?外植體 ?采用玉米自交系GS01的胚性愈傷組織作為遺傳轉化的受體進行轉化，由吉林農業大學生物技術中心實驗室提供。

1.1.2 ?菌種 ?含有phyA基因和玉米根部特異啟動子基因構建的重組質粒pCAMBIA3301-ZmGLU1P-PhyA-Nos的根癌農桿菌EHA105，由吉林農業大學生物技術中心實驗室保存并提供。

1.1.3 ?培養基 ?本試驗所用的培養基見表1。

1.2 ?方法

1.2.1 ?抗性愈傷篩選標記的確定 ?本研究所構建的表達載體為Bar基因的篩選標記，篩選培養采用除草劑篩選的方法，即用草胺磷進行篩選。

1.2.2 ?農桿菌介導轉化玉米愈傷組織

1）農桿菌菌液的制備。將帶有質粒pCAMBIA3301-ZmGLU1P-PhyA-Nos單菌落，接種于含5 mL卡那霉素的5 mL YEP液體培養基中，于27 ℃、200 r/min培養過夜，再轉入50 mL YEP液體培養基中，培養至對數生長期（OD600 nm在0.5～0.6）時，收集菌體，重懸于MS液體培養基中待用。

2）玉米愈傷組織的誘導。取授粉12～16 d的玉米自交系GS01的幼穗，先用75%乙醇消毒8～10 min，再用0.5%次氯酸鈉浸泡消毒12～15 min，無菌水洗2～5次后，在無菌條件下取幼胚接種于誘導培養基上，26 ℃暗培養3～4周，產生Ⅰ型愈傷組織，每隔2～3周繼代1次，誘導出Ⅱ型胚性愈傷組織，作為農桿菌轉化的受體材料。

3）農桿菌轉化玉米愈傷組織。將含有質粒pCA

MBIA3301-ZmGLU1P-PhyA-Nos的農桿菌EAH105的單菌落，接種于LB液體培養基（含有50 mg/L 卡那霉素）中，27 ℃、180 r/min振蕩培養至對數生長期（OD600 nm達到不同值），收集菌體，用同體積侵染培養基重懸菌體，用此菌液在三角瓶中侵染胚性愈傷組織15～25 min，每隔5 min振蕩1次，然后收集菌體，倒掉菌液，將愈傷組織放入鋪有無菌濾紙的培養皿中，吸干愈傷組織表面多余的菌液，然后轉入共體培養基中（附加200 μg/L AS）中27 ℃暗培養3 d左右。

4）愈傷組織的篩選、分化及植株再生。將愈傷組織移入篩選培養基中（含一定濃度的除草劑），篩選生長旺盛的新鮮的抗性愈傷繼代3次（每15～20 d左右繼代1次），抗性愈傷轉至分化培養基中，分化出苗，再轉入生根培養基生根。再移栽到培養室盆栽，最后移栽到大田，進行田間栽培。

2 ?結果與分析

2.1 ?不同菌液濃度對玉米抗性愈傷組織轉化率的影響

農桿菌的生長時期不同，侵染能力有很大差別，農桿菌濃度過高或過低都會影響其轉化率，本研究分別取OD600 nm為0.5、0.6和0.7用于轉化玉米GS01愈傷組織。結果表明，農桿菌生長到對數中期時OD600 nm為0.6時具有最高的轉化率，在這個時期農桿菌感染能力最強（表2）。

2.2 ?不同侵染時間對玉米抗性愈傷組織轉化率的影響

利用農桿菌侵染不同玉米愈傷組織時，侵染時間的長短對其轉化率也有重要的影響。侵染時間過短，農桿菌不能充分吸附在外植體上，從而降低了抗性愈傷組織轉化率;相反，若農桿菌侵染時間過長，由于農桿菌大量繁殖而造成抑菌困難則會使外植體褐化死亡，二者都會降低抗性愈傷組織轉化率。因此，對侵染時間進行研究，確定最佳的侵染時間是十分必要的。本研究設定農桿菌侵染時間分別為15、20和25 min。結果表明，侵染時間為20 min時具有最高的抗性愈傷組織轉化率（表2）。

2.3 ?不同激素對玉米抗性愈傷組織分化及再生的影響

在A、B、C、D培養基中分別添加了不同濃度的6-BA、IBA和KT，研究不同激素單獨及配合使用對玉米幼胚愈傷組織的誘導效果（表3）。由表3可看出，A、B、C和D 4種培養基對玉米幼胚愈傷組織的分化效果不同，其中B、C培養基上的分化率分別為17.6%和15.4%，再生率為9.6%和9.1%，即分化培養時，相同條件下，2.0 mg/L的6-BA比1.0 mg/L的KT效果好;A、D兩種培養基上的分化率和再生率分別為20.5%、19.4%和18.6%、14.5%，A培養基上的分化與再生效果要好于D培養基，即0.8 mg/L IBA與1.5 mg/L 6-BA配合使用對玉米抗性愈傷的分化和再生效果要好于加入1.0 mg/L KT和1.0 mg/L 6-BA的培養基;而A、D兩培養基上的分化率和再生率均高于B、C兩種培養基，說明不同種類和濃度的激素配合使用對抗性愈傷組織分化和再生的效果更好。

3 ?小結與討論

本試驗利用農桿菌介導法將phyA基因導入玉米自交系GS01的胚性愈傷組織中，通過Bar基因的篩選標記，使用除草劑進行抗性愈傷的篩選，并優化了農桿菌介導的玉米愈傷組織遺傳轉化條件。結果表明，①當菌液濃度OD600 nm為0.6時，抗性愈傷組織轉化率最高;②侵染時間20 min為愈傷組織的適宜侵染時間;③不同濃度的激素搭配使用有利于抗性愈傷組織的分化和再生。

農桿菌介導法轉化玉米愈傷組織除了受基因型、愈傷組織狀態及菌種種類等因素影響外，農桿菌菌液的濃度、侵染愈傷組織時間和添加不同的激素也會對其產生重要的影響。如果農桿菌菌液濃度過低，那么就會導致農桿菌附著于外植體傷口處的濃度低，以至于不能進行充分轉化;而菌液濃度過高，那么農桿菌生長已處于對數生長后期，侵染能力會下降，易導致在共培養時農桿菌的過度增長，加大了對愈傷組織的損害，導致了外植體的褐化死亡。如果侵染時間過短，只有很少的農桿菌吸附在外植體上，導致T-DNA不能有效轉移或轉化的細胞不夠多，從而降低了抗性愈傷組織轉化率;相反，若農桿菌侵染時間過長，農桿菌會過度繁殖，最終導致農桿菌的污染或因農桿菌毒性過強而使外植體褐化死亡，二者都可以降低抗性愈傷組織轉化率[14-16]。培養基中添加不同種類和濃度的激素對抗性愈傷組織的分化與也起著重要的作用，在本試驗設定條件下，6-BA對抗性愈傷組織分化及再生的效果比KT好，不同種類和濃度的激素配合使用對抗性愈傷組織分化和再生的效果好。

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