水稻染色質重塑因子CHR729對激素代謝的影響

李健健

摘要：CHR729是水稻（Oryza sativa L.）CHD3類染色質重塑因子，廣泛參與水稻生長發育進程，并影響全基因組明顯表達和組蛋白修飾，測定了多種植物內源激素在chr729突變體中的含量，探討了CHR729與激素代謝之間的聯系。結果表明，在苗期地上部分和成熟期劍葉中，chr729突變體內源生長素（IAA），脫落酸（ABA），茉莉酸（JA）含量明顯降低，生長素合成以及ABA合成基因的表達在chr729突變體中均呈下調表達。樹脂切片結果顯示，chr729突變體中莖稈成熟組織細胞明顯變小，居間分生組織細胞大小無明顯變化。苗期檢測細胞分裂素氧化酶/脫氫酶（CKX）基因表達發現，chr729突變體中CKX1、CKX2、CKX4基因表達量升高，伴隨一些位點組蛋白變體H2A.Z富集程度的上升，表明CHR729可能抑制H2A.Z在基因組上的裝載，廣泛參與水稻激素代謝調控。

關鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）;染色質重塑因子;激素;干旱

中圖分類號：Q756 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）02-0468-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.055

Effects of Rice Chromatin Remodeler CHR729 on Hormone Metabolism

LI Jian-jian

（College of Life Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract：CHR729 is a CHD3 chromatin remodeler playing multiple roles in growth and development of rice. Previous studies indicated that CHR729 modulate a subset of gene expression and histone modifications. The contents of multiple endogenous phytohormones were measured. The correlation of CHR729 with hormone dynamics was investigated. A significant decrease in endogenous auxin， abscisic acid and jasmonic acid was observed in chr729 seedlings and mature flag leaves. Genes involved in auxin or abscisic acid biosynthesis were down-regulated in chr729 mutant. The cell length in mature tissue and intercalary meristem in stem was examined. A significant decrease in cell length of mature tissue of chr729 was found. Cell size of intervening meristem had no significant changes. Some cytokinin oxidase/dehydrogenase genes were up-regulated in chr729 mutant， with a relatively high enrichment of histone variant H2A.Z at some loci， indicating the involvement of CHR729 in the deposition/removal of H2A.Z. It is implied that CHR729 was involved in multiple hormone metabolisms of rice.

Key words： rice; chromatin remodeler; phytohormone; drought

植物激素是植物合成產生的一類小分子化合物。截至目前，多種分子被認定為植物激素，包括生長素或吲哚乙酸（IAA）、細胞分裂素、脫落酸（ABA）、赤霉素、乙烯、油菜素甾醇、茉莉酸、水楊酸等，均對植物生長發育起著重要的調控作用。生長素調控植物向性運動、頂端優勢、根的發生等一系列生理過程[1-3]。細胞分裂素參與頂端優勢、莖分生組織形成、葉片衰老、營養物質的運輸、種子萌發以及植物抗病應答等[4]。脫落酸調控種子休眠，并在植物非生物脅迫響應中發揮重要作用[5]。茉莉酸參與植物抗病，影響植物發育[6]。在不同的環境條件下，植物激素含量是高度動態的。

真核生物的遺傳物質存在于染色質中，染色質是經多級組裝形成的高度動態的結構。染色質的不同狀態，影響轉錄機器對DNA序列的接近與識別。染色質結構的動態變化主要受到兩類復合物調控，一類是組蛋白共價修飾酶類;另一類是ATP依賴的染色質重塑復合物。SWI2/SNF2家族的ATP酶是染色質重塑復合物的核心成員，其通過水解ATP釋放能量，驅動染色質構象發生改變，增加或者降低DNA結合蛋白對DNA序列的可接近程度，進而調控基因的表達[7]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中一些SWI2/SNF2家族成員已被鑒定參與調控擬南芥生長發育的多個進程。CHD3類染色質重塑因子PICKLE（PKL）參與擬南芥種子萌發，主根和側根的發育，根分生組織活性以及心皮的分化[8-15];另一個染色質重塑因子BRAHMA（BRM）調控擬南芥莖和葉片的發育以及開花等過程[16-19]。此外，PKL和BRM也與多種激素調控相關，如生長素、細胞分裂素、脫落酸等[12，20-23]。

水稻（Oryza sativa）的染色質重塑因子CHR729也已被鑒定出來，CHR729功能缺失造成水稻多種生長缺陷，例如植株矮小、近軸面葉片白化、開花期推遲等[5，24]。CHR729基因缺失影響全基因組水平大量基因的表達和組蛋白修飾[24]。然而，CHR729是否影響激素代謝仍不清楚，本研究通過測定多種內源植物激素的含量，發現IAA、ABA、JA含量在chr729突變體中顯著降低，激素代謝相關基因的表達也受到CHR729功能突變的影響，CHR729影響水稻多種激素代謝。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本試驗使用的亞洲栽培稻粳稻品種分別為中花11（Oryza sativa L. subsp. japonica cv. Zhonghua 11），HY（Oryza sativa L. subsp. japonica cv. Hwayoung）和SSBM（Oryza sativa L. subsp. japonica cv. Ishikari-shiroge）。CHR729基因的兩個等位突變體分別為T-DNA插入突變體chr729，背景為HY，EMS誘變突變體oschr4，背景為SSBM。

1.2 ?幼苗處理

1）CHR729表達模式驗證時，正常成長的野生型中花11在不同生長時期進行取樣并誘導愈傷取樣，取樣部位包括愈傷、幼苗、葉片、劍葉、莖和穗子。

2）聚乙二醇和脫落酸處理試驗時，將在生根培養基上無菌狀態下發芽13 d的幼苗移出無菌環境煉苗1 d后，分別用20% PEG 6000和2 μmol/L ABA浸泡幼苗并在不同的時間點取樣。

1.3 ?基因表達檢測

野生型HY和chr729突變體水稻種子去殼并經過表面消毒后，接種至生根培養基上，正常光照條件下生長11 d后取地上部分，按照TRIzol試劑（Invitrogen公司）說明書提取水稻RNA。取4 μg總RNA，用1 μL DNase I （invitrogen） 37 ℃ 消化15 min去除 DNA污染，加1 μL 25 mmol/L EDTA后，冰上放置5 min，65 ℃滅活10 min;在冰上冷卻2 min后，加1 μL Oligo dT15（100 ng）和1 μL 10 mmol/L dNTPs 65 ℃靜置5 min;冰上放置2 min，加入4 μL 5×Buffer、1 μL ?M-MLV、1 μL HPRI（RNA 酶抑制劑）、2 μL 0.1 mol/L DTT，37 ℃反轉錄1.5 h;100 ℃滅活10 min，加入140 μL ddH2O。Real-time PCR使用ABI SYBR green試劑盒，儀器為ABI 7500 Real time PCR system。每個樣品以肌動蛋白（actin）為內參，重復3次。

1.4 ?組蛋白突變體H2A.Z在基因位點的富集檢測

染色質免疫沉淀（ChIP）操作方法參照文獻[25]。取正常條件下生根培養11 d的水稻幼苗約2 g置于1%甲醛中真空下交聯后液氮中研磨，染色質被超聲波打成200～750 bp的片段，以H2A.Z抗體進行免疫沉淀。抗體沉淀前后的DNA以基因特異性引物進行熒光定量PCR檢測，分析H2A.Z在基因位點的富集情況。

1.5 ?激素測定

植物內源激素IAA、ABA和JA的含量測定參照文獻[26]進行。取正常條件下生根培養11 d的水稻幼苗地上部分約0.1 g，液氮研磨后加入到750 μL預冷的提取緩沖液中（甲醇∶水∶醋酸=80∶19∶1），緩沖液中加入內標（10 ng 2H6 ABA，10 ng DHJA， 5 ng D2-IAA，3 μg NAA），4 ℃搖床300 r/min避光提取16 h以上。4 ℃，13 000 r/min離心15 min后轉移上清液，沉淀繼續以400 μL緩沖液重懸，搖床提取4 h以上。離心后合并上清液，用1 mL注射器吸取合并的上清并過0.22 μm濾膜（津騰公司，尼龍66）至另一離心管中，在通風櫥中用氮氣吹干，加200 μL甲醇顛倒幾次后4 ℃溶解3～6 h。4℃、13 000 r/min離心15 min，輕輕吸取上清液150～180 μL至內插管中，放置于質譜專用上樣瓶中用于質譜分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?聚乙二醇和脫落酸對CHR729基因表達的影響

為了解CHR729基因的功能，對水稻多個組織或器官中CHR729基因表達進行了分析。定量PCR結果表明，CHR729基因廣泛表達于多個組織或器官，包括愈傷、幼苗、葉片、劍葉、莖和穗子等（圖1A）。其中，在葉片和愈傷中，CHR729基因的表達量相對較高，表明CHR729在葉片和愈傷中可能發揮重要功能，并且chr729突變體葉片近軸面白化、葉片變窄，愈傷褐化（圖1B、圖1C）也驗證了這一點。CHR729基因突變導致多種生長缺陷，為了說明CHR729是否在增強水稻對環境的適應性方面發揮功能，分別檢測了幼苗經聚乙二醇（PEG）處理或者脫落酸（ABA）處理后CHR729基因的表達情況。結果（圖1D、圖1E）表明，CHR729基因的表達受到PEG和ABA的誘導。

2.2 ? CHR729基因突變對植物激素的影響

植物激素在植株正常生長發育中發揮重要作用，為了說明chr729突變體產生的多種表型是否與激素水平有關，分別對苗期地上部分和成熟期劍葉中IAA、ABA和JA的含量進行了分析。由圖2可以看出，CHR729基因突變后，IAA、ABA和JA的含量均明顯下降。為了說明CHR729是否影響激素合成，在幼苗期地上部分對生長素合成基因表達進行檢測，發現生長素合成相關的大部分YUCCA類基因的表達量在突變體中均下降。此外，對苗期ABA合成相關基因的表達也發現，OsZEP、OsLCY、OsZDS、OsPDS的表達在CHR729基因的兩個等位突變體（chr729和oschr4）中表達量均下降，說明CHR729基因影響了ABA合成。

2.3 ?干旱對chr729突變體的影響

CHR729基因的表達受到PEG和ABA的誘導，且chr729突變體中內源ABA含量降低，推測CHR729可能參與抗旱應答。通過測定野生型與chr729突變體離體葉片失水速率，發現chr729突變體中失水速率比野生型快。進一步對野生型和chr729突變體植株進行干旱處理，發現chr729突變體在干旱條件下葉片更容易表現出卷曲的表型，而正常澆水條件下，葉片均表現為自然伸展，說明CHR729基因突變后，植株對干旱敏感性增強（圖3）。

2.4 ?CHR729對細胞分裂和伸長的影響

chr729突變體表現出株高變矮的表型，為了說明株高變矮與細胞分裂和細胞伸長的關系，對成熟莖稈進行了縱向樹脂切片，并對居間分生組織和成熟組織細胞大小進行了統計。結果表明，chr729突變體成熟組織中細胞大小比野生型細胞明顯變小，而居間分生組織突變體與野生型的細胞大小無明顯差異，說明chr729突變體株高變矮與成熟組織細胞伸長減弱有關。此外，通過細胞分裂素氧化酶/脫氫酶（CKX）的表達可以反映細胞分裂的快慢。對CKX基因的表達模式進行了分析，發現CKX1、CKX2、CKX4、CKX5、CKX8、CKX11在苗期地上部分有表達。進一步Real-time PCR驗證發現在chr729突變體幼苗地上部分CKX1、CKX2、CKX4基因的表達明顯上升，同時染色質免疫沉淀（ChIP）發現突變體中H2A.Z在CKX2、CKX4、CKX8、CKX11的基因位點富集程度明顯高于野生型，說明CHR729可能通過抑制H2A.Z在基因組一些位點的裝載進而抑制基因的表達（圖4）。

3 ?小結與討論

3.1 ?CHR729在水稻激素代謝中的作用

植物激素在植物的正常生長過程中有著非常重要的作用。在擬南芥中，PKL和BRM與多種激素應答有關[12，20-23]，水稻chr729突變后會出現多種表型[5，24]。本研究分析結果也表明，CHR729突變會導致多種激素水平的下降，包括IAA、ABA和JA，并且伴隨著IAA和ABA合成相關基因表達量的下降以及細胞分裂素分解代謝相關基因表達量的上升。進一步推測CHR729可以通過調整體內不同激素水平或者調控激素應答以調控水稻的正常生長。

3.2 ?CHR729在H2A.Z裝載過程中的抑制作用

組蛋白突變體H2A.Z通常會被SWR1類的ATP酶裝載到基因5末端，從而促進相應基因的轉錄[27-29]，并被INO80類的ATP酶清除以抑制基因的表達[30]。擬南芥中與SWR1復合物組分的同源蛋白被報道參與了葉片發育、開花、DNA修復、體細胞重組、減數分裂以及系統獲得性抗性應答等過程[31-34]，擬南芥INO80蛋白則參與控制同源重組過程[35]，CHD蛋白家族也被報道參與組蛋白H3突變體的裝載過程[36-39]，但它與H2A.Z突變體之間的聯系還不是很清楚。本研究發現CHR729能夠抑制H2A.Z在一些基因位點的富集，進而調控基因的表達。

3.3 ?CHR729影響ABA的應答

多數植物染色質重塑因子重塑機制并不清楚，但是也有報道相繼闡述了其在逆境應答中的功能。在擬南芥中，染色質重塑因子PKL和BRM并不受外源ABA誘導，在沒有受到非生物逆境時，它們通過組蛋白修飾H3K9me2和H3K27me2以及高密度的核小體抑制ABI3和ABI5的表達，從而降低了非逆境條件下ABA的應答[22，40]。與之相反，擬南芥SWI3同源蛋白AtSWI3B，屬于SNF2染色質重塑復合物成員，卻可以通過維持ABA應答基因RAB18和RD29B的表達促進對ABA的響應[41]。這些結果說明染色質重塑因子對ABA的調控是雙向的，既可以促進，也可以抑制其作用。本研究發現染色質重塑因子基因CHR729受到PEG和ABA誘導，并且chr729突變體對干旱處理高度敏感，這些結果表明CHR729在水稻抗旱中發揮作用，但是具體的機制仍需進一步研究。

參考文獻：

[1] WOODWARD A W，BARTEL B. Auxin： Regulation， action， and interaction[J]. Ann Bot， 2005， 95（5）：707-735.

[2] CHAPMAN E J，ESTELLE M. Mechanism of auxin-regulated gene expression in plants[J]. Annu Rev Genet， 2009，43：265-285.

[3] TEALE W D， PAPONOV I A，PALME K. Auxin in action： Signalling， transport and the control of plant growth and development[J]. Nat Rev Mol Cell Biol， 2006， 7（11）：847-859.

[4] WERNER T， MOTYKA V， LAUCOU V， et al. Cytokinin-deficient transgenic Arabidopsis plants show multiple developmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in the regulation of shoot and root meristem activity[J]. Plant Cell， 2003， 15（11）：2532-2550.

[5] ZHAO C， XU J， CHEN Y， et al. Molecular cloning and characterization of OsCHR4， a rice chromatin-remodeling factor required for early chloroplast development in adaxial mesophyll[J]. Planta， 2012， 236（4）：1165-1176.

[6] LYONS R， MANNERS J M，KAZAN K. Jasmonate biosynthesis and signaling in monocots： A comparative overview[J]. Plant Cell Rep， 2013， 32（6）：815-827.

[7] CLAPIER C R，CAIRNS B R. The biology of chromatin remodeling complexes[J]. Annu Rev Biochem， 2009， 78：273-304.

[8] AICHINGER E， VILLAR C B， DI MAMBRO R， et al. The CHD3 chromatin remodeler PICKLE and polycomb group proteins antagonistically regulate meristem activity in the Arabidopsis root[J]. Plant Cell， 2011， 23（3）：1047-1060.

[9] AICHINGER E， VILLAR C B， FARRONA S， et al. CHD3 proteins and polycomb group proteins antagonistically determine cell identity in Arabidopsis[J]. PLoS Genet，2009，5（8）：e1000605.

[10] OGAS J， CHENG J C， SUNG Z R， et al. Cellular differentiation regulated by gibberellin in the Arabidopsis thaliana pickle mutant[J]. Science， 1997， 277：91-94.

[11] OGAS J， KAUFMANN S， HENDERSON J， et al. PICKLE is a CHD3 chromatin-remodeling factor that regulates the transition from embryonic to vegetative development in Arabidopsis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1999， 96（24）：13839-13844.

[12] FUKAKI H， TANIGUCHI N，TASAKA M. PICKLE is required for SOLITARY-ROOT/IAA14-mediated repression of ARF7 and ARF19 activity during Arabidopsis lateral root initiation[J]. Plant J， 2006， 48（3）：380-389.

[13] ESHED Y， BAUM S F，BOWMAN J L. Distinct mechanisms promote polarity establishment in carpels of Arabidopsis[J]. Cell， 1999， 99（2）：199-209.

[14] DEAN R S， HENDERSON J T， JEROME R E， et al. Coordinate repression of regulators of embryonic identity by PICKLE during germination in Arabidopsis[J]. Plant J， 2003， 35（1）：33-43.

[15] LI H C， CHUANG K， HENDERSON J T， et al. PICKLE acts during germination to repress expression of embryonic traits[J]. Plant J， 2005， 44（6）：1010-1022.

[16] FARRONA S， HURTADO L， BOWMAN J L， et al. The Arabidopsis thaliana SNF2 homolog AtBRM controls shoot development and flowering[J]. Development， 2004， 131（20）：4965-4975.

[17] HURTADO L， FARRONA S，REYES J C. The putative SWI/SNF complex subunit BRAHMA activates flower homeotic genes in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Mol Biol， 2006， 62（1-2）：291-304.

[18] FARRONA S， HURTADO L， MARCH-DIAZ R， et al. Brahma is required for proper expression of the floral repressor FLC in Arabidopsis[J]. PLoS One， 2011， 6（3）：e17997.

[19] TANG X， HOU A， BABU M， et al. The Arabidopsis BRAHMA chromatin-remodeling ATPase is involved in repression of seed maturation genes in leaves[J]. Plant Physiol， 2008， 147（3）：1143-1157.

[20] HENDERSON J T， LI H C， RIDER S D， et al. PICKLE acts throughout the plant to repress expression of embryonic traits and may play a role in gibberellin-dependent responses[J]. Plant Physiol， 2004， 134（3）：995-1005.

[21] FURUTA K， KUBO M， SANO K， et al. The CKH2/PKL chromatin remodeling factor negatively regulates cytokinin responses in Arabidopsis calli[J]. Plant Cell Physiol， 2011， 52（4）：618-628.

[22] HAN S K， SANG Y， RODRIGUES A， et al. The SWI2/SNF2 chromatin remodeling ATPase BRAHMA represses abscisic acid responses in the absence of the stress stimulus in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2012， 24（12）：4892-4906.

[23] ARCHACKI R， BUSZEWICZ D， SARNOWSKI T J， et al. BRAHMA ATPase of the SWI/SNF chromatin remodeling complex acts as a positive regulator of gibberellin-mediated responses in Arabidopsis[J]. PLoS One， 2013， 8（3）：e58588.

[24] HU Y， LIU D， ZHONG X， et al. CHD3 protein recognizes and regulates methylated histone H3 lysines 4 and 27 over a subset of targets in the rice genome[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2012， 109（15）：5773-5778.

[25] LI T， CHEN X， ZHONG X， et al. Jumonji C domain protein JMJ705-Mediated removal of histone H3 lysine 27 trimethylation is involved in defense-related gene activation in rice[J]. Plant Cell， 2013， 25（11）：4725-4736.

[26] LIU H， LI X， XIAO J， et al. A convenient method for simultaneous quantification of multiple phytohormones and metabolites： Application in study of rice-bacterium interaction[J]. Plant Methods， 2012， 8（1）：2.

[27] ZILBERMAN D， COLEMAN-DERR D， BALLINGER T， et al. Histone H2A.Z and DNA methylation are mutually antagonistic chromatin marks[J]. Nature， 2008， 456：125-129.

[28] MIZUGUCHI G， SHEN X， LANDRY J， et al. ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex[J]. Science，2004，303：343-348.

[29] ZHANG H， ROBERTS D N，CAIRNS B R. Genome-wide dynamics of Htz1， a histone H2A variant that poises repressed/basal promoters for activation through histone loss[J]. Cell， 2005， 123（2）：219-231.

[30] PAPAMICHOS-CHRONAKIS M， WATANABE S， RANDO O J， et al. Global regulation of H2A.Z localization by the INO80 chromatin-remodeling enzyme is essential for genome integrity[J]. Cell， 2011， 144（2）：200-213.

[31] CHOI K， PARK C， LEE J， et al. Arabidopsis homologs of components of the SWR1 complex regulate flowering and plant development[J]. Development，2007，134（10）：1931-1941.

[32] LAZARO A， GOMEZ-ZAMBRANO A， LOPEZ-GONZALEZ L， et al. Mutations in the Arabidopsis SWC6 gene， encoding a component of the SWR1 chromatin remodelling complex， accelerate flowering time and alter leaf and flower development[J]. J Exp Bot， 2008， 59（3）：653-666.

[33] MARCH-DIAZ R， GARCIA-DOMINGUEZ M， LOZANO-JUSTE J， et al. Histone H2A.Z and homologues of components of the SWR1 complex are required to control immunity in Arabidopsis[J]. Plant J， 2008， 53（3）：475-487.

[34] ROSA M， VON HARDER M， CIGLIANO R A， et al. The Arabidopsis SWR1 chromatin-remodeling complex is important for DNA repair， somatic recombination， and meiosis[J]. Plant Cell， 2013， 25（6）：1990-2001.

[35] FRITSCH O， BENVENUTO G， BOWLER C， et al. The INO80 protein controls homologous recombination in Arabidopsis thaliana[J]. Mol Cell， 2004， 16（3）：479-485.

[36] WALFRIDSSON J， BJERLING P， THALEN M， et al. The CHD remodeling factor Hrp1 stimulates CENP-A loading to centromeres[J]. Nucleic Acids Res， 2005， 33（9）：2868-2879.

[37] HARADA A， OKADA S， KONNO D， et al. Chd2 interacts with H3.3 to determine myogenic cell fate[J]. EMBO J， 2012， 31（13）：2994-3007.

[38] KONEV A Y， TRIBUS M， PARK S Y， et al. CHD1 motor protein is required for deposition of histone variant H3.3 into chromatin in vivo[J]. Science， 2007， 317：1087-1090.

[39] RADMAN-LIVAJA M， QUAN T K， VALENZUELA L， et al. A key role for Chd1 in histone H3 dynamics at the 3' ends of long genes in yeast[J]. PLoS Genet， 2012， 8（7）：e1002811.

[40] PERRUC E， KINOSHITA N，LOPEZ-MOLINA L. The role of chromatin-remodeling factor PKL in balancing osmotic stress responses during Arabidopsis seed germination[J]. Plant J， 2007， 52（5）：927-936.

[41] SAEZ A， RODRIGUES A， SANTIAGO J， et al. HAB1-SWI3B interaction reveals a link between abscisic acid signaling and putative SWI/SNF chromatin-remodeling complexes in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2008， 20（11）：2972-2988.