培養基和植物生長調節劑對青錢柳 懸浮細胞三萜產量的影響

NGUYEN Thi-xuyen 方升佐 NGUYEN Quang-ha范龔健 NGO Anh-son 鄧 波

(1.南京林業大學林學院，江蘇 南京 210037；2.越南北江農林大學森林學院, 北江 236217)

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培養基和植物生長調節劑對青錢柳 懸浮細胞三萜產量的影響

NGUYEN Thi-xuyen1,2方升佐1NGUYEN Quang-ha1,2范龔健1NGO Anh-son1,2鄧 波1

(1.南京林業大學林學院，江蘇 南京 210037；2.越南北江農林大學森林學院, 北江 236217)

探討培養基種類和植物生長調節劑配比對青錢柳懸浮細胞生長、總三萜和三萜單體含量及產量的影響。結果表明:MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT最適合青錢柳懸浮細胞生長，最終產量達到12.03 g/L；WPM+0.5 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L NAA顯著提高了青錢柳懸浮細胞中總三萜的含量；青錢柳懸浮細胞中均能檢出阿江欖仁酸、青錢柳酸B、齊墩果酸和熊果酸的存在，且阿江欖仁酸和青錢柳酸B含量較高，但基本培養基種類和不同植物生長調節劑組合對懸浮細胞中4種三萜單體含量無顯著影響。青錢柳懸浮細胞中總三萜產量以MS+0.5 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L NAA處理最高，而三萜單體產量均以MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT處理最高。

青錢柳； 懸浮細胞;生物量；總三萜；三萜單體；三萜產量

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)系胡桃科青錢柳屬植物，是我國特有的單種屬植物，為高大速生落葉喬木[1],主要分布于廣西、江西、福建、浙江、安徽、湖南、湖北、四川、貴州、河南等地的山區、溪谷或石灰巖山地。青錢柳木材密度比中國傳統的槍托用材胡桃楸(Juglansmandshurica)還大，而與優良家具、槍托和機模用材黃杞(Engelhardtiaroxburghiana)很相近[2]。青錢柳作為一種木本藥用植物已引起了人們極大的關注,目前已從青錢柳葉中分離出20個單體化合物，鑒定出15個化合物的結構，5個為自然界中發現的新化合物[3-4]，此外，青錢柳葉中還含有豐富的內酯類和黃酮類化合物[5-6]。然而，由植物次生代謝途徑生成的有效藥用成分的含量較低，且受原料、季節等條件的限制[7]，特別是青錢柳本身繁殖困難，可利用資源匱乏[8]。因此，青錢柳葉用資源難以滿足市場需求，研究利用青錢柳細胞培養技術生產黃酮和三萜等次生代謝產物對大規模商業化生產青錢柳重要活性成分具有重要的現實意義。關于細胞懸浮培養技術，國內外已有不少報道[9-11]，但關于青錢柳懸浮細胞培養技術的研究僅見Yin等的報道[12]。本研究分析了培養基種類和植物生長調節劑配比對青錢柳懸浮細胞的生長、總三萜和三萜單體富集的影響，旨在為提高青錢柳懸浮培養細胞的品質和青錢柳懸浮細胞開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1) 青錢柳愈傷組織：由南京林業大學森林資源與環境學院森林培育實驗室提供。

2) 繼代培養基：以MS培養基為基礎，添加1.0 mg/L萘乙酸(NAA)，1.0 mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)，3%蔗糖和0.6%瓊脂。

1.2 試驗設計及培養條件

1.2.1培養基種類 分析MS培養基、WPM培養基和改良DKW培養基對青錢柳懸浮細胞培養生產三萜的影響。選生長旺盛的愈傷組織2.0 g，接種于100 mL MS培養基、WPM培養基和改良DKW液體培養基上，同時添加1.0 mg/L NAA、0.5 mg/L KT和3%蔗糖。

1.2.2植物生長調節劑配比 在培養基種類研究的基礎上，選擇懸浮細胞生物產量最高的MS培養基分析不同的植物生長調節劑組合對青錢柳懸浮細胞生產三萜的影響。選生長旺盛的愈傷組織2.0 g，接種于100 mL MS液體培養基上，分別添加植物生長調節劑組合1(1.0 mg/L NAA+ 0.5 mg/L KT)，組合2(0.5 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L NAA)和組合3(1.0 mg/L IBA+ 0.5 mg/L TDZ)作為誘導劑，同時均添加3%蔗糖。

1.2.3培養條件 培養基pH均為6.0，在相對濕度50%～60%，溫度(23±2)℃，轉速為115 r/min搖床上暗培養10 d，然后進行光培養，光培養7～10 d繼代1次。繼代時，采用40目不銹鋼篩過濾培養物以除去較大的細胞團塊，保留分散程度較好的小細胞團和單細胞，按V(過濾后培養液)∶V(新鮮培養液)=1∶2繼代培養。經反復繼代后建立懸浮細胞系，4個月左右收獲細胞置于烘箱烘干進行懸浮細胞生物量、總三萜和各三萜組分含量測定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1總三萜含量測定 參考舒任庚等的比色法測定青錢柳中三萜類成分的含量[13],精確吸取齊墩果酸標準母液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0和1.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，待揮干溶劑后，各加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，高氯酸1.4 mL，然后用乙酸乙酯定容至10 mL，搖勻，在70 ℃水浴中放置15 min，然后在560 nm處測定吸光度。以吸光度為橫坐標，三萜的濃度為縱坐標繪制標準曲線(y=0.517x-0.010 2；R2= 0.993 1)。

將各處理所得的懸浮細胞于60 ℃烘箱中干燥，干燥后碾成粉末。取粉末0.4 g(精確到萬分之一)于大試管中，按料液比為1∶30加70%乙醇，在70 ℃條件下超聲輔助重復提取3次，過濾合并提取液，在60 ℃水浴中揮發提取液至近干，然后用70%乙醇清洗定容至10 mL。每個配方重復3次，測定總三萜含量。

1.3.2三萜單體含量測定 配制不同濃度的齊墩果酸、熊果酸、阿江欖仁酸和青錢柳酸B標準溶液，采用HPLC法測定青錢柳三萜單體含量。檢測器為紫外檢測器，進樣量為10 μL，洗脫液A為水，洗脫液B為乙腈，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，洗脫順序為:1) 0～10 min，洗脫劑A 20%+洗脫劑B 80%至洗脫劑A 10%+洗脫劑B 90%梯度洗脫；2) 10～30 min，洗脫劑A 10%+洗脫劑B 90%等度洗脫。

以三萜單體峰面積為縱坐標，三萜濃度為橫坐標，制作青錢柳三萜標準曲線，結果如下。

1) 阿江欖仁酸出峰時間3.13 min，標準曲線為：y=5 500.6x-16.679(R2=0.999 4)。

2) 青錢柳酸B出峰時間3.35 min，標準曲線為：y=7 320.5x-9.043 4(R2=0.999 7)。

3) 齊墩果酸出峰時間為10.41 min，標準曲線為：y=5 543.4x-2.737 9(R2=0.999 9)。

4) 熊果酸出峰時間為10.77 min，標準曲線為：y=4 190.4x+4.953 8(R2=0.999 7)。

按照上述方法測定樣品中各三萜組分的含量。

1.4 數據分析

試驗設3次重復，結果以平均值±標準偏差表示。數據用軟件SAS 6.0分析。

2 結果與分析

2.1 培養基種類和植物生長調節劑配比對懸浮細胞生物量的影響

培養基種類和植物生長調節劑配比對青錢柳懸浮細胞干質量的影響結果見圖1。

由圖1a可知，培養基種類顯著影響青錢柳懸浮細胞的產量。MS培養基中青錢柳懸浮細胞生長良好，經繼代培養后最終產量達到12.03 g/L，顯著高于WPM和改良DKW培養基(P<0.05)；但WPM和改良DKW培養基中的青錢柳懸浮細胞干質量含量差異不顯著(P>0.05)。由此可見，MS適合青錢柳懸浮細胞的生長。

植物生長調節劑種類也顯著影響青錢柳懸浮細胞的產量(P<0.05)。圖1b表明，以MS作為基本培養基時，組合1(1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT)誘導培養獲得的青錢柳懸浮細胞干質量最大，組合2(0.5 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L NAA)誘導后獲得的青錢柳懸浮細胞干質量次之，組合3(1.0 mg/L IBA+ 0.5 mg/L TDZ)誘導獲得的青錢柳懸浮細胞干質量最少，僅為組合1產量的40%左右。

2.2 培養基種類和植物生長調節劑配比對懸浮細胞三萜含量的影響

培養基種類和植物生長調節劑配比對青錢柳懸浮細胞總三萜含量的影響結果見圖2。

不同培養基中青錢柳懸浮細胞總三萜含量差異顯著(P<0.05)，WPM培養基中總三萜含量顯著高于其他2種， MS和改良DKW兩者間差異不顯著(圖2a)。植物生長調節劑組合顯著影響青錢柳懸浮細胞總三萜的含量(圖2b)。組合2誘導的青錢柳懸浮細胞中總三萜含量最高，達到11.59 mg/g，組合1和組合3間差異不顯著。

培養基種類和植物生長調節劑配比對青錢柳懸浮細胞三萜單體含量的影響結果見圖3。由圖3可知，經3種培養基培養獲得的青錢柳懸浮細胞中均檢出4種三萜單體。其中，阿江欖仁酸在MS和WPM培養基中均有較高的含量，而在改良DKW培養基中產量較低；青錢柳酸B在3種培養基中含量均較高，達到4.60 mg/g以上；而齊墩果酸和熊果酸在3種培養基中含量均較低。由此可見，青錢柳懸浮細胞培養可以富集阿江欖仁酸和青錢柳酸B，而齊墩果酸和熊果酸的產量較低。

本研究選擇的3種植物生長調節劑均能誘導青錢柳懸浮細胞產出4種三萜單體。經組合1培養后，阿江欖仁酸含量顯著高于其余2種組合(P<0.05)；青錢柳酸B含量在3種組合誘導培養的懸浮細胞中差異不顯著(P>0.05)；齊墩果酸和熊果酸在3種組合誘導培養的青錢柳細胞中含量較低，且三者之間差異間不顯著(P>0.05)。由此可見，組合1最適于誘導青錢柳懸浮細胞富集阿江欖仁酸和青錢柳酸B。

2.3 培養基種類和植物生長調節劑配比對懸浮細胞三萜產量的影響

不同培養基種類對青錢柳懸浮細胞培養體系中三萜產量的影響結果見表1。由表1可知，培養基種類顯著影響青錢柳懸浮細胞中總三萜的產量，MS培養基中獲得的總三萜含量最高，WPM培養基次之，改良DKW培養基最低。培養基種類也顯著影響各三萜單體的產量，其對4種三萜單體產量的影響規律同總三萜產量一致。其中，MS培養基中獲得的青錢柳懸浮細胞中，4種三萜產量均顯著高于其余2種培養基中所獲得的產量。

植物生長調節劑配比對青錢柳懸浮細胞培養體系中三萜產量的影響結果見表2。植物生長調節劑配比顯著影響青錢柳懸浮細胞中總三萜的產量，組合1和組合2中獲得的總三萜產量差異不顯著，但均顯著高于組合3。植物生長調節劑配比也顯著影響各三萜單體的產量，其對4種三萜單體產量的影響規律同總三萜產量一致。其中，組合1中獲得的青錢柳懸浮細胞中，4種三萜產量均顯著高于其余2種培養基，組合2次之，組合3中獲得的4種三萜產量均最低。

表1 不同培養基種類培養下青錢柳懸浮細胞培養體系中三萜產量

表2 不同植物生長調節劑配比下青錢柳懸浮細胞培養體系中三萜產量

3 結論與討論

培養基種類和植物生長調節劑配比顯著影響青錢柳懸浮細胞培養中三萜類化合物的積累。MS培養基有利于青錢柳懸浮細胞的生長，富集阿江欖仁酸和青錢柳酸B，并能獲得較高的青錢柳總三萜產量；植物生長調節劑組合2雖然有利于青錢柳懸浮細胞總三萜的富集，但組合1對青錢柳懸浮細胞生長有促進作用，且能夠獲得最高的總三萜和三萜單體產量。

基礎培養基提供植物細胞生長所需的各類物質，而不同科屬的植物對營養物質的需求不盡相同，所以在植物細胞懸浮培養時，對培養基的種類要求也不同。本試驗選取3種常見培養基，探討了培養基種類對青錢柳細胞懸浮培養生長和三萜的影響，為青錢柳細胞懸浮培養生產活性物質提供參考依據。本試驗發現，青錢柳懸浮細胞在含鹽量較高的MS培養基中生長較好，而在WPM中獲得的總三萜含量最高。對于旨在生產代謝產物的細胞培養，選擇培養基時既要考慮有利于細胞生長的培養基，也要考慮有利于目的產物積累的培養基。楊芳[14]研究發現，MS培養基雖有利于丹參懸浮細胞的生長，但是6,7-V培養基更利于丹參酚酸的合成積累，因此，綜合考慮應選擇6,7-V培養基作為丹參懸浮細胞培養基。本研究結果顯示，青錢柳懸浮細胞產量在MS培養基上生長最高達到12.03 g/L；總三萜含量在WPM培養基上效果最好；青錢柳懸浮細胞三萜單體中阿江欖仁酸在MS和WPM培養基中產量最高，在改良DKW培養基中產量較低；青錢柳酸B在3種培養基中含量較高，均達到4.60 mg/g；而齊墩果酸和熊果酸在3種培養基中含量較低。

培養基的類型、碳源種類、植物生長調節劑種類及質量濃度、接種量、裝液量、初始pH及搖床轉速等因素均能影響細胞生長。其中，植物生長調節劑對細胞生長具有重要的調控作用，選擇合適的植物生長調節劑配比對促進細胞的生長具有重要作用。本研究發現：NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L的組合對青錢柳懸浮細胞的含量效果最大；而2，4-D 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L的組合總三萜含量最高；NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L的組合顯著提高阿江欖仁酸含量，2，4-D 0.5 mg/L +NAA 0.3 mg/L和NAA 1.0 mg/L+ KT 0.5 mg/L的組合有利于青錢柳酸B含量累積。NAA 1.0 mg/L + KT 0.5 mg/L的組合最適于青錢柳懸浮細胞富集阿江欖仁酸和青錢柳酸B。總體看，生長素對青錢柳懸浮細胞生長的影響要大于細胞分裂素。

植物細胞懸浮培養時，細胞起始密度對懸浮細胞生長影響較大。因為植物細胞間的聯系通常比微生物細胞的聯系密切得多，細胞要維持分裂和生長，其內源代謝物質必須達到一定的閾值，在有較高密度細胞群和培養基營養豐富的情況下，易于達到這種閾值。但如果接種密度過大，可能引起氧和營養物質的傳輸受限，導致細胞衰竭[15]。不同植物所需的起始密度各不相同。韋曉新等[16]研究表明，30 g/L(鮮質量)的接種量適合于鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)原球莖的生長；陳書安等[17]研究表明，在接種量為5%時，藏紅花(Crocussativus)懸浮細胞生物量達到最高。關于接種量對青錢柳懸浮細胞生長的影響有待于今后進一步探討和研究。

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(責任編輯 張 坤)

Effects of Culture Mediums and Plant Hormones on Triterpenoid Production in the Cell Suspension Culture ofCyclocaryapaliurus

NGUYEN Thi-xuyen1,2,FANG Sheng-zuo1,NGUYEN Quang-ha1,2,FAN Gong-jian1, NGO Anh-son1,2,DENG Bo1

(1.College of Forestry, Nanjing Forestry University,Nanjing Jiangsu 210037,China; 2.College of Forestry,Vietnam Bac Giang University of Agriculture and Forestry,Bac Giang 236217, Vietnam)

Effects of basic culture mediums and plant hormones on suspension cell growth,contents and productions of total triterpenes,oleanolic acid,ursolic acid,arjunolic acid and cyclocaric acid B in the cell suspension culture ofCyclocaryapaliuruswere investigated in this study.The results showed that MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT were most suitable for suspension cell growth ofC.paliurus,and ultimately production reached 12.03 g/L.WPM+0.5 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L NAA significantly improved total triterpenoid content in the suspension cells.Arjunolic acid,paliurus acid B,oleanolic acid and ursolic acid were detected in all the suspension cells,but the content of arjunolic acid and paliurus acid B was much higher than the others.However,basic culture mediums and plant hormones did not significantly affect the content of oleanolic acid,ursolic acid,arjunolic acid andcyclocaric acid B in the suspension cells.The greatest production of total triterpenoids was achieved in MS+0.5 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L NAA, while the highest yield of different triterpenoid monomers was observed in MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT.

Cyclocaryapaliurus;suspended cell;biomass;total triterpenoids;triterpenoid monomer;triterpenoid production

2014-06-13

國家自然科學基金項目( 31270673)資助；江蘇高校協同創新計劃“南方現代林業協同創新中心”資助；江蘇高校優勢學科建設工程項目(PAPD)資助。

方升佐(1963—)，男，教授，博士生導師。研究方向：森林培育。Email:fangsz@njfu.edu.cn。

10.11929/j.issn.2095-1914.2015.01.002

S723.1

A

2095-1914(2015)01-0006-06

第1作者：NGUYEN Thi-xuyen(1978—)，女，博士。研究方向：森林培育。Email:1727573169@qq.com。