丹酚酸A、B及其分子藥對配伍對腎纖維化過程中CTGF及Par-3的干預作用

趙任杰 吳丹彤 李 均 姚 蘭

(1 成都軍區總醫院腎內科，成都，610083； 2 遵義醫學院珠海校區,珠海，519000)

丹酚酸A、B及其分子藥對配伍對腎纖維化過程中CTGF及Par-3的干預作用

趙任杰1吳丹彤2李 均2姚 蘭2

(1 成都軍區總醫院腎內科，成都，610083； 2 遵義醫學院珠海校區,珠海，519000)

目的：觀察丹酚酸A、B及其分子藥對配伍對腎纖維化中CTGF及Par-3表達的影響。方法：采用50只雄性SPF級SD大鼠隨機分為5組：正常組、造模組、丹酚酸A組、丹酚酸B組及丹酚酸A+B組。除正常組外，其余大鼠均造成UUO模型。各組予相應藥物治療2周，腹主動脈采血檢測大鼠Cr、BUN；免疫熒光觀察大鼠腎組織CTGF、Par-3表達情況。結果：1)腎功能檢測：模型組大鼠血清Cr，BUN水平顯著高于正常組(P<0.05)。丹酚酸A組大鼠血清Cr水平明顯低于模型組(P<0.05)；丹酚酸A組和丹酚酸B組大鼠血清BUN水平明顯低于模型組(P<0.05)；各治療組間比較，血清Cr和BUN水平差異無統計學意義(P>0.05)。2)CTGF免疫熒光檢測：和正常組相比，模型組大鼠腎組織腎小管上皮細胞陽性細胞數目明顯增多，熒光強度明顯增強(+++)；經丹酚酸A、B及組分配伍治療后，CTGF熒光強度較模型組明顯減弱，其中以丹酚酸A+B組減弱較為明顯(±)，丹酚酸B組次之(+)。3)Par-3免疫熒光檢測結果：模型組大鼠腎組織腎小管上皮細胞陽性細胞數目比正常組明顯減少，熒光強度明顯減弱(±)；經丹酚酸A、B及組分配伍治療后，丹酚酸A、B、A+B組Par-3熒光強度較模型組明顯增強，其中以丹酚酸A+B組增強較為明顯(+++)，丹酚酸B組次之(++)。結論：經丹酚酸A、B及其分子藥對配伍治療后，可一定程度改善大鼠腎功能，但無統計學意義；丹酚酸組分配伍組能顯著抑制大鼠腎組織CTGF的表達、促進Par-3的表達，其效果優于丹酚酸A和丹酚酸B組。該機制可能與其促進Par-3在UUO大鼠腎組織中的表達和減少CTGF的表達有關。

腎纖維化；丹酚酸A；丹酚酸B；CTGF；Par-3

腎間質纖維化是各類慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)進展到終末期腎衰竭的共同通路，其發生、發展和多種細胞因子密切相關[1]。結締組織生長因子(Connective Tissue Growth Factor，CTGF)對成纖維細胞具有趨化、促有絲分裂及分化等作用。大量研究進一步發現，CTGF與包括血管、心臟[2]、腎臟[3-4]、胰腺[5]、肺[6]及肝臟[7]等許多組織器官纖維化的發生發展密切相關。CTGF被認為是TGF-β1的直接下游效應遞質[8]，主要在瘢痕形成、損傷修復與病理狀態下纖維化的形成方面起作用。細胞極性蛋白-3(Polarity complex protein-3，Par-3)是Par復合物的一種核心蛋白，在維持細胞間緊密鏈接、上皮細胞極性及足細胞形態上有重要作用[9-11]。實驗證實，高表達Par-3可部分減輕腎小管上皮細胞轉分化(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)的程度。因此，通過干預CTGF及Par-3的表達有可能成為治療腎纖維化疾病一個新的靶點。

本課題采用體內單側輸尿管梗阻(Unilateral Ureteral Obstruction，UUO)模型，觀察臨床常用防治腎纖維化的藥物丹參水溶性成分(丹酚酸A、丹酚酸B及其分子藥對配伍)對UUO模型CTGF和Par-3表達的影響，國內外未見臨床報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要儀器

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠50只(購自廣東省醫學實驗動物中心，許可證號：SYXK(粵)2008-0002，合格證號NO.440072000)，鼠齡7～8周，體重220～250 g。飼養于SPF級動物房，自由飲水，日常光照。適應性飼養3 d后，無不良反應即進入實驗。

1.1.2 實驗藥物 丹酚酸A、丹酚酸B購買自上海融禾醫藥科技發展有限公司,有效組分純度均為98%,(批號分別為120821、120910)。兔抗大鼠CTGF多克隆抗體(Abcam：產品編號ab6692)；兔抗大鼠Par-3多克隆抗體(Santa cruz：產品編號sc-5598)；熒光二抗—山羊抗兔IgG-FITC(中杉金橋：產品編號ZF-0311)；肌酐(Cr)檢測試劑盒(Roche：產品編號62154001)；尿素氮(BUN)檢測試劑盒(Roche：產品編號62098501)；DAPI工作液(Roche：產品編號NO.10236276001)。

1.1.3 主要儀器 倒置熒光顯微鏡(DMIRB，DIC)，Leica，Germany；-80 ℃低溫冰柜，Forma Scientic,Germany。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥 50只清潔級雄性SD大鼠適應性飼養3 d后，隨機分為正常對照組(n=10)和造模型組(n=40)。正常對照組給予自由進食和飲水，造模組按文獻方法制備單側輸尿管梗阻(UUO)模型[12]：以3%戊巴比妥鈉，按0.2 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后用橡皮筋固定大鼠，使其呈俯臥位，剃去右背部毛發，暴露皮膚，用碘伏消毒其擬行手術切口位置及周圍約5 cm左右，共3遍，鋪無菌手術洞巾。在距脊柱約1～1.5 cm處做長約1～1.5 cm的縱行切口，逐層剝離皮下組織，鈍性剝離肌肉，打開腹膜，暴露出腎盂及右輸尿管，玻璃分針分離輸尿管，先于近腎門處結扎輸尿管，再于遠離腎門處結扎輸尿管，最后在兩結扎線之間離斷輸尿管，術中避免損傷腎臟及臨近組織或器官，而后逐層縫合，關閉腹腔，碘伏消毒皮膚切口，無菌敷料覆蓋包扎。造模后隨機分為4組，第2天開始灌胃，連續14 d：UUO模型組(n=10)，每天按2 mL/200 g予生理鹽水灌胃；丹酚酸A組(n=10)，丹酚酸A溶液12.5 mg/kg·d灌胃；丹酚酸B組(n=10)，丹酚酸B溶液12.5 mg/kg·d灌胃；丹酚酸A+B組(n=10)，丹酚酸A及丹酚酸B各6.25 mg/kg·d灌胃。正常組(n=10)，每天按2 mL/200 g予生理鹽水灌胃。

1.2.2 觀察指標及方法 1)大鼠腎功能測定：大鼠用藥后2周，腹主動脈采血，通過149全自動生化分析儀檢測大鼠血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)。2)免疫熒光檢測CTGF、Par-3：麻醉狀態下取出結扎側腎臟，制備腎組織切片。將切片置于電熱鼓風干燥箱中60 ℃干燥60 min，予以常規脫蠟至水；抗原修復完后，予PBS洗3次，每次3 min；滴加山羊血清封閉液，置于37 ℃下孵育10 min，甩干后加入CTGF多克隆抗體(1∶100)或PAR3多克隆抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜；在室溫中復溫45 min，予PBS洗3次，5 min/次，再滴加按比例稀釋的含FITC標示的熒光二抗(1∶80)，遮光，60 min，然后再用PBS洗3次，5 min/次；滴加DAPI工作液，37 ℃復染10 min，PBS充分洗滌；免疫熒光專用封片劑封片，熒光顯微鏡觀察采圖。同時用PBS作陰性對照，其他操作程序同上。3)CTGF、Par-3結果判定：采用目前通用的5級分法，即(±～++++)級：(±)級：低倍鏡下熒光信號不能被查見，高倍鏡下似乎可見；(+)級：低倍鏡下模糊可見熒光信號而高倍鏡下可顯見；(++)級：低倍鏡下熒光信號顯見，高倍鏡下清晰顯見熒光信號；(+++)級：低倍鏡下熒光信號清楚顯見，高倍鏡下炫目；(++++)級：高倍鏡下熒光信號刺眼。

2 結果

2.1 丹酚酸A、B及其分子配伍對UUO大鼠腎功能的影響 如表1所示：UUO組大鼠血清Cr和BUN水平均比正常組明顯上升(P<0.05)，說明造模后大鼠腎功能受損。與模型組比較，丹酚酸A組可明顯降低大鼠血清Cr水平(P<0.05)，余治療組大鼠血清Cr水平均呈下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，說明丹酚酸A、B可在一定程度上改善UUO大鼠的腎功能；與模型組比較，丹酚酸A組和丹酚酸B組可明顯降低大鼠血清BUN水平(P<0.05)，余治療組血清BUN水平呈下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠腎功能的檢測結果±s)

注:用*表示與正常組比較，P<0.05；△表示與模型組比較,P<0.05。

2.2 丹酚酸A、B及其分子配伍對UUO大鼠腎組織CTGF、Par-3表達的影響

2.2.1 CTGF免疫熒光結果 熒光顯微鏡下察見：CTGF陽性表達信號呈綠色，在UUO大鼠腎組織表達部位主要定位于腎小管上皮細胞。正常組大鼠腎組織腎小管上皮細胞多呈陰性，熒光強度較弱(±)；和正常組相比，模型組大鼠腎小管上皮細胞陽性細胞數目明顯增多，熒光強度明顯增強(+++)；經丹酚酸A、B及組分配伍治療后，CTGF熒光強度較模型組明顯減弱，其中以丹酚酸A+B組減弱較為明顯(±)，丹酚酸B組次之(+)，丹酚酸A組較模型組熒光略有減弱(++)，詳見圖1-圖5。

2.2.2 Par-3免疫熒光表達結果 熒光顯微鏡下觀察可見：Par-3陽性表達信號呈綠色，在UUO大鼠腎組織表達部位主要在腎小管上皮細胞胞質。正常組大鼠腎組織腎小管上皮細胞多呈陽性，熒光強度較強(+++)；模型組大鼠腎小管上皮細胞陽性細胞數目比正常組明顯減少,熒光強度明顯減弱(±)；經丹酚酸A、B及組分配伍治療后，丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸A+B組Par-3表達信號較之模型組顯著加強，而以丹酚酸A+B組增強較為明顯(+++)，丹酚酸B組次之(++)，丹酚酸A組熒光略有增強(+)，詳見圖6-圖10。

3 討論

本課題選用臨床抗腎纖維化常用中藥丹參水溶性活性成分中結構相似的丹酚酸A、丹酚酸B組分進行分子藥對配伍(1∶1)應用，丹酚酸B采用最佳劑量12.5 mg/kg·d給藥[13]，丹酚酸A等劑量代換，丹酚酸A+B均按照1∶1比例配伍給藥(根據課題組前期預實驗結果確定用藥劑量和比例)。

結締組織生長因子(CTGF)屬于CNN生長因子家族(也稱CCN2)[5]。CTGF被認為是一種由TGF-β1誘導產生的致纖維化蛋白[14]，CTGF在功能上與TGF-β1具有很大的相似性,較之TGF-β1，CTGF的最大特點就是生物學功能比較單一，主要表現在對纖維化的影響[15]。在CTGF啟動子序列128～162位置上存在著一個重要的轉化生長因子-β1(TGF-β1)調控元件。經研究證實，CTGF可被TGF-β1誘導表達，并作TGF-β1主要的下游遞質介導其促纖維化作用，其在成纖維細胞內過度表達，與腎纖維化的發生密切相關[16]。實驗證實，減少CTGF表達可減輕UUO大鼠模型的腎間質纖維化[3]。在慢性間質性腎疾病，隨腎間質損害程度加重，表達CTGF mRNA細胞數量顯著增多，并隨間質纖維化程度加重而增多[17]。在腎纖維化模型中，用CTGF的反義治療可以減輕腎纖維化的反應[18]。此外有實驗報道：CTGF在糖尿病腎病的腎纖維化中發揮重要作用[19-20]。Par-3屬于蛋白酶激活受體(PARs)家族，是G蛋白偶聯受體(GPCRs)的一個亞家族，是一種極性蛋白[21-23]。研究證實：在哺乳動物的上皮細胞，Par-3有兩個亞型(Par3A和Par3B)，它與Par-6、aPKC蛋白共同構成蛋白激酶復合體，參與緊密連接的組成[24]。Par-3不僅是蛋白激酶復合體的一個核心蛋白，而且也是緊密連接所必需的，起著極其重要的作用。鄰近細胞間形成的緊密連接是細胞極性的一個重要體現。腎小管上皮細胞的轉分化(EMT)被認為可致細胞外基質(ECM)的不斷積聚，最終導致腎功能的不可逆損害[25-27]。細胞極性的喪失和連接的破壞是EMT過程中的始動關鍵環節[28]。有研究表明，當基因敲除Par-3分子后，將導致細胞連接松散，細胞分化改變[29-30]。此外，實驗證實：通過誘導PAR-3蛋白表達增加，可發揮延緩腎纖維化的作用[31]。

本實驗結果表明：模型組CTGF熒光強度明顯增強，各治療組熒光強度減弱，以丹酚酸A+B組減弱較為明顯；模型組Par-3熒光強度減弱，各治療組熒光強度增強，以丹酚酸A+B組增強較為明顯。說明丹酚酸A、B及其分子藥對可減少CTGF表達、增多Par-3表達，且組分配伍效果更明顯。

綜上所述，丹酚酸A、B及其分子藥對配伍對UUO大鼠腎臟具有一定的保護作用，其機制可能與其減少腎組織CTGF的表達，促進Par-3的表達，從而影響腎纖維化過程中腎小管上皮細胞轉分化有關。丹酚酸A、B及其分子藥對可干預CTGF和Par-3的表達，且丹酚酸A、B分子藥效果更明顯。

[1]胡堯，張先覺，李又空.腎纖維化的藥物治療進展[J].長江大學學報：自科版，2013(3)：103-108.

[2]Li L,Chen F,Cao YG,et al.Role of calcium-sensing receptor in cardiac injury of hereditary epileptic rats[J].Pharmacology，2015，95(1-2):10-21.

[3]Sun W,Yin XJ,Tu Y,et al.Effects and mechanisms of Qifu decoction ameliorating renal tubulointerstitial fibrosis through inhibiting ERK1/2 signaling pathway in unilateral ureteral obstruction rats with yang deficiency[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,2014,39(21):4082-4089.

[4]Lee S,Kim SI,Choi ME.Therapeutic targets for treating fibrotic kidney diseases[J].Transl Res，2015,165(4):512-530.

[5]Charrier A,Brigstock DR.Regulation of pancreatic function by connective tissue growth factor (CTGF,CCN2)[J].Cytokine Growth Factor Rev，2013,24(1):59-68.

[6]趙敏,徐安莉,周艷艷，等.溫補腎陽法對腎陽虛肺纖維化大鼠肺內CTGF表達的影響[J].中國老年學雜志,2015,35(2):421-424.

[7]Chunqiu Hao,Yumei Xie,Meijuan Peng,et al.Inhibition of connective tissue growth factor suppresses hepatic stellate cell activation in vitro and prevents liver fibrosis in vivo[J].Clinical and Experimental Medicine,2014,14(2):141-150.

[8]朱祎,唐英,何立群,等.大黃酚對單側輸尿管梗阻模型大鼠腎組織CTGF、α-SMA和FN的影響[J].中南藥學,2014,12(7):631-634.

[9]李或,陳朝青,李亞東.姜黃素對單側輸尿管梗阻大鼠腎小管上皮細胞分化及TGF-β1/Smads信號轉導途徑的影響[J].中國中西醫結合雜志2011,31(9):1224-1228.

[10]McCaffrey,L.M.,et al.,Loss of the Par3 polarity protein promotes breast tumorigenesis and metastasis[J].Cancer Cell,2012，22(5)：601-614.

[11]Zhang Y,Wang W,Chen J,et al.Structural insights into the intrinsic self-assembly of Par-3 N-terminal domain[J].Structure,2013，21(6):997-1006.

[12]李均,王冬,曹軼璇,等.黃芪丹參有效組分不同比例配伍對腎纖維化模型大鼠腎小管上皮細胞轉分化的影響[J].上海中醫藥大學學報,2012，26(1):68-72.

[13]陸海英,周娟,陸敏,等.丹參酚酸B對實驗性腎間質纖維化大鼠的保護作用及其機制[J].中藥材，2010，33(11):1755-1759.

[14]王文文,程錦國.纖維化疾病中的TGF-β/CTGF協同軸[J].山西中醫學院學報,2013,14(1):76-78.

[15]Kobayashi,H.,et al.,Connective tissue growth factor and progressive fibrosis in biliary atresia[J].Pediatr Surg Int,2005，21(1):12-16.

[16]Tall,E.G,et al.,TGF-beta-stimulated CTGF production enhanced by collagen and associated with biogenesis of a novel 31-kDa CTGF form in human corneal fibroblasts[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2010,51(10):5002-5011.

[17]Nogare AL,Dalpiaz T,Pedroso JA,et al.Expression of fibrosis-related genes in human renal allografts with interstitial fibrosis and tubular atrophy[J].J Nephrol，2013,26(6):1179-1187.

[18]Liu Y1,Li W,Liu H,et al.Inhibition effect of small interfering RNA of connective tissue growth factor on the expression of extracellular matrix molecules in cultured human renal proximal tubular cells[J].Ren Fail，2014,36(2):278-284.

[19]Cheng M,Liu H,Zhang D,et al.HMGB1 Enhances the AGE-Induced Expression of CTGF and TGF-β via RAGE-Dependent Signaling in Renal Tubular Epithelial Cells[J].Am J Nephrol,2015,41(3):257-266.

[20]Khan S,Jena G,Tikoo K.Sodium valproate ameliorates diabetes-induced fibrosis and renal damage by the inhibition of histone deacetylases in diabetic rat[J].Exp Mol Pathol,2015,98(2):230-239.

[21]Isabel Canto,Unice J.K.Soh,JoAnn Trejo.Allosteric Modulation of Protease-activated Receptor Signaling[J].Mini Rev Med Chem，2012,12(9):804-811.

[22]Gieseler,F.,etal.,Proteinase-activatedreceptors(PARs)-focusonreceptor-receptor-interactions and their physiological and pathophysiological impact[J].Cell Commun Signal,2013，11:86.

[23]Wei Feng,Hao Wu,Ling-Nga Chan,Par-3-mediated Junctional Localization of the Lipidhosphatase PTEN Is Required for Cell Polarity Establishment[J].The Journal of Biological Chenistry，2008，284(4):2340-2344.

[24]Toshinori Matsui,Takashi Watanabe,Kenji Matsuzawa,et al.PAR3 and aPKC regulate Golgi organization through CLASP2 phosphorylation to generate cell polarity[J].Mol Biol Cell，2015,26(4):751-761.

[25]Tang,R,et al.,Epithelial-mesenchymal transdifferentiation of renal tubular epithelial cells induced by urinary proteins requires the activation of PKC-alpha and betaI isozymes[J].Cell Biol Int,2011,35(9):953-959.

[26]Wiwanitkit,V,Fibrosis and evidence for epithelial-mesenchymal transition in the kidneys of patients with staghorn calculi[J].BJU Int,2011,107(11):1847.

[27]徐浩岑.人參皂苷Rg1對腎小管上皮細胞轉分化的抑制作用及其與VEGFR2、EPOR表達變化的關系[D].南京：南京中醫藥大學,2013.

[28]Wang,Z.and S.S.Li.Numb：A new player in EMT[J].Cell Adh Migr,2010，4(2):176-179.

[29]McCaffrey,L.M.,et al.Loss of the Par3 polarity protein promotes breast tumorigenesis and metastasis[J].Cancer Cell,2012，22(5):601-614.

[30]Iden S.,et al.Tumor type-dependent function of the par3 polarity protein in skin tumorigenesis[J].Cancer Cell,2012，22(3):389-403.

[31]王冬.黃芪丹參藥對及其有效組分抗腎纖維化的實驗研究[D].遵義：遵義醫學院,2012.

(2014-12-23收稿 責任編輯：徐穎)

Intervention Effect of Salvianolic acid A, B on CTGF and Par-3 Expression in the Process of Renal Fibrosis

Zhao Renjie1, Wu Dantong2, Li Jun2, Yao Lan2

(1ChengDuMilitaryGeneralHospitalDepartmentofNephrology,Chengdu610083,China; 2ZhuhaiCampus,ZunyiMedicalCollege,Zhuhai519000,China)

Objective: To investigate the intervention effect of Salvianolic acid A, B and their component molecules of drug compatibility on expression of CTGF and Par-3 in the process of renal fibrosis. Methods: A total of 50 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups: normal group (n=10), the control group (n=10), salvianolic acid A group (n=10), salvianolic acid B group (n=10) and salvianolic acid A and B group (n=10). All rats were made into unilateral ureteral obstruction (UUO) model except the normal group. After two weeks of treatment, we took blood sample from abdominal aorta and examined Cr and BUN levels; and observed CTGF, Par-3 protein expression in kidney tissue by immunofluorescence. Results: 1)Results of renal function test: model group's serum Cr level was significantly higher than the normal group (P<0.05); the Sal A group's serum Cr level was obviously lower than the model group (P<0.05); the serum BUN levels in the Sal group A and group B significantly lower than the model group; among the treatment groups, serum Cr and BUN levels showed no significant difference (P> 0.05). 2)Results of CTGF immunofluorescence test: the number of rat renal tubular epithelial cells showing positive in model group significantly increased compared to the control group and the fluorescence intensity significantly enhanced (+++); after treatment of Sal A, B, and component compatibility, CTGF fluorescence intensity was reduced compared with the model group , among which the Sal A+B group decreased significantly (±) and followed by the Sal B group (+). 3)Results of Par-3 immunofluorescence test: the number of positive cells in rat renal tubular epithelial cells in the model group was significantly decreased than the normal group and the fluorescence intensity was significantly reduced (±); after treatment of Sal A, B and component compatibility, Par-3 the fluorescence intensity in the Sal A, Sal B, Sal A+B group was significantly enhanced compared with the model group , among which the Sal A+B group enhanced most obviously (+++), and followed by the Sal group B (++). Conclusion: Sal A, B and component compatibility treatment could partly improve rat's renal function, but showed no significant difference. The Sal A+B group could significantly inhibit the expression of CTGF in renal tissue and promote expression of Par-3, and its effect was better than the Sal A group and Sal B group. It may be related to promoting the expression of Par-3 and reducing the expression of CTGF in UUO kidney tissue of rats.

Renal interstitial fibrosis; Salvianolic acid A; Salvianolic acid B; CTGF; Par-3

國家自然科學基金項目丹酚酸A、B、C分子藥對配伍對腎纖維化過程中PDGF-C/PDGFR-α信號途徑的干預作用(編號：81260603)

李均(1966.12—)，男，博士研究生，主任醫師，碩士研究生導師，博士，主要從事中醫藥防治慢性腎臟病的研究，E-mail：lijun69-1214

R285.6;R256.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.06.024