伊拉地平對MPP+損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用的實驗研究

李 俊，王訓(xùn)翠，李慶林

(1．安徽中醫(yī)藥大學(xué);2．省部共建新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，安徽合肥 230038)

帕金森病(PD)是一種以黑質(zhì)紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失和紋狀體多巴胺含量顯著減少為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。據(jù)統(tǒng)計，到2030年，世界范圍內(nèi)50歲以上人群中，將會有930萬人受困擾［1－2]。常用于PD動物模型的試劑有1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)、魚藤酮(rotenone)、百草枯、6-羥基多巴(6-OHDA)［3]。其中MPTP在體內(nèi)代謝為1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)后，進(jìn)入線粒體，抑制氧化呼吸鏈復(fù)合體I(complex I)酶的活性，致使多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷。因此，MPP+損傷細(xì)胞建立帕金森病體外模型的實驗方法已獲得公認(rèn)［4]。

在帕金森病患者中，特有的現(xiàn)象是SNc多巴胺能神經(jīng)元中線粒體復(fù)合酶I活性明顯下降［5]。線粒體膜電位(ΔΨm)的變化會影響線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔，改變線粒體跨膜電位和線粒體的形態(tài)，并能增加細(xì)胞膜通透性，引起細(xì)胞能量代謝障礙。細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生90%左右來自于線粒體，文獻(xiàn)報道也證實氧化應(yīng)激與線粒體途徑的細(xì)胞死亡關(guān)系密切［6]。

伊拉地平是一種新型的二氫吡啶類鈣通道阻滯劑。有研究顯示，伊拉地平在帕金森病動物模型中具有保護(hù)作用［7]，可延緩、甚至中止帕金森病病情。本實驗研究探討伊拉地平對MPP+損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用及作用機制的研究。

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑 ISR(批號:111213)獲贈于安徽省新星藥物開發(fā)有限責(zé)任公司，純度99．0%;噻唑藍(lán)(MTT):Amersco進(jìn)口分裝，武漢生命技術(shù)有限公司;DMEM:Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS):美國Hyclone公司;PBS:北京中杉生物技術(shù)有限公司;1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+):Sigma公司。

1．2 實驗細(xì)胞 PC12細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1．3 方法

1．3．1 MTT法檢測細(xì)胞存活率 培養(yǎng)細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液配制2×108·L－1細(xì)胞懸液，100 μL每孔接種于96孔板。實驗設(shè)置正常對照組，MPP+處理組，MPP++ISR組，每組6個復(fù)孔。置37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜后，按分組要求給與不同濃度藥物處理，培養(yǎng)24 h后，每孔加5 g·L－1的 MTT溶液10μL，37℃下繼續(xù)孵育4 h后，除去培養(yǎng)液，加入150μL DMSO，低速震蕩10 min，充分溶解藍(lán)色結(jié)晶。以酶標(biāo)儀490 nm波長下檢測每孔吸光度值。細(xì)胞活性以與正常對照組相比的百分?jǐn)?shù)表示。

1．3．2 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測 取對數(shù)生長期的細(xì)胞以2×109·L－1接種培養(yǎng)于6孔板，實驗分組與處理同前，培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，離心(1 500 r·min－1，5 min)收集各組細(xì)胞，細(xì)胞重懸于終濃度為10μmol·L－1的二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(2＇，7＇-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)不含血清的培養(yǎng)液中，吹勻，避光條件下培養(yǎng)20 min，熒光強度使用流式細(xì)胞儀(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)檢測。

1．3．3 JC-1檢測線粒體膜電位(MMP) 收集各組細(xì)胞，加入終濃度為5 mg·L－1JC-1染液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育20 min，以800 r·min－1低速離心5 min，去上清，培養(yǎng)基清洗3次，細(xì)胞重懸，繼續(xù)培養(yǎng)20 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用 t檢驗，并且用 SPSS 17．0軟件包進(jìn)行處理，P＜0．05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 ISR對MPP+損傷的PC12細(xì)胞存活率的影響 如圖1所示，隨著MPP+濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸下降，MPP+濃度為1 mmol·L－1時，細(xì)胞生長明顯受到抑制，與正常對照組比較，MPP+組細(xì)胞存活率為(56．4 ±7．1)%(P ＜0．01);0．5 ～2 μmol·L－1ISR對MPP+損傷的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，并呈一定的量效依賴性。因此，以1 mmol·L－1MPP+作為最佳造模濃度，以2μmol·L－1ISR作為最佳給藥劑量，見圖1。

2．2 伊拉地平對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ROS的影響 與正常對照組比較，1 mmol·L－1MPP+處理PC12細(xì)胞24 h后，熒光強度明顯增強，提示細(xì)胞內(nèi)ROS生成明顯升高，2μmol·L－1伊拉地平處理組熒光強度明顯低于MPP+組，結(jié)果表明伊拉地平能夠抑制MPP+誘導(dǎo)的ROS生成。見圖2。

2．3 伊拉地平對MPP+損傷的PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響 實驗結(jié)果顯示，1 mmol·L－1MPP+處理PC12細(xì)胞24 h后，線粒體膜電位顯著降低，2 μmol·L－1伊拉地平預(yù)處理后，線粒體膜電位升高。結(jié)果提示伊拉地平可能通過阻止線粒體膜電位的下降而抑制線粒體損傷的發(fā)生。見圖3。

3 討論

帕金森病發(fā)病的核心環(huán)節(jié)之一是線粒體功能障礙。線粒體膜電位是反應(yīng)線粒體內(nèi)膜通透性的主要標(biāo)志［8]，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transit pore，MPTP)的開放將導(dǎo)致線粒體膜電位降低。本研究結(jié)果表明，與正常對照組相比，模型組線粒體膜電位顯著降低，伊拉地平預(yù)處理后線粒體膜電位顯著升高。此研究結(jié)果提示神經(jīng)毒物MPP+引起線粒體MPTP開放，降低線粒體膜電位，伊拉地平能夠阻止這一損傷的發(fā)生。

氧化應(yīng)激是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后繼發(fā)性損害的主要機制。腦缺血缺氧，ROS生成增多，氧化系統(tǒng)與氧化應(yīng)激失衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［9]。正常情況下，神經(jīng)組織內(nèi)ROS的消除和生成處于動態(tài)平衡狀態(tài);在病理狀態(tài)及環(huán)境因素刺激下，ROS生成過多或干擾抗氧化防御系統(tǒng)功能，破壞這種動態(tài)平衡，觸發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的興奮毒性導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡［10]。因此，在神經(jīng)退行性疾病防治中清除氧化應(yīng)激因子或抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生具有重要意義。本實驗結(jié)果表明，與正常對照組相比，MPP+引起細(xì)胞內(nèi)ROS的升高，ISR能抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，表明ISR對受損細(xì)胞的保護(hù)作用可能與改善線粒體氧化應(yīng)激有關(guān)。

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