阿奇霉素對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道炎癥和氣道黏液高分泌的影響*

任　薇，孫耕耘，王　勝，熊玲玲，朱春冬，李春穎，周　群(安徽醫科大學第一附屬醫院呼吸內科，安徽合肥3003;安徽中醫藥大學第一附屬醫院干部呼吸內科，安徽合肥300)

·短篇論著·

阿奇霉素對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道炎癥和氣道黏液高分泌的影響*

任薇1，2，孫耕耘1△，王勝2，熊玲玲2，朱春冬2，李春穎2，周群2
(1安徽醫科大學第一附屬醫院呼吸內科，安徽合肥230031;2安徽中醫藥大學第一附屬醫院干部呼吸內科，安徽合肥230022)

目的:研究阿奇霉素對慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)模型大鼠的防治作用，從氣道炎癥及黏液高分泌角度探討其作用機制。方法:將18只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、慢阻肺模型組、阿奇霉素治療組，每組6只。通過煙熏及大鼠氣管內注入脂多糖(LPS)的方法建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型。HE染色觀察大鼠肺組織病理變化。肺功能儀檢測大鼠肺通氣功能。ELISA檢測各組大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞介素(IL) -8、IL-17和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。Western blot及real-time PCR檢測支氣管肺組織中MUC5ac和Toll樣受體4(TLR4)蛋白及mRNA的表達。結果:模型組大鼠支氣管肺組織HE染色結果符合慢阻肺病理改變。與模型組比較，治療組損傷程度顯著減輕。模型組與對照組比較，肺功能明顯下降，大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明顯增高(P＜0. 05)，肺組織中MUC5ac和TLR4蛋白及mRNA表達水平顯著增高(P＜0. 05)。與模型組比較，治療組肺功能的下降減輕，大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量的升高受到明顯抑制(P＜0. 05)，肺組織中MUC5ac和TLR4蛋白及mRNA表達水平的受到明顯抑制(P＜0. 05)。結論:阿奇霉素可降低慢阻肺模型大鼠BALF中IL-8、IL-17和TNF-α水平，抑制肺組織內MUC5ac和TLR4蛋白表達，通過減輕氣道炎癥及黏液高分泌來達到防治慢阻肺的作用。

慢性阻塞性肺疾病;阿奇霉素;氣道炎癥;氣道黏液高分泌

［ABSTRACT］AIM: To observe the effect of azithromycin on the rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD)，and to explore the underlying mechanism about the airway inflammation and mucus hypersecretion.METHODS: Male SD rats were randomly divided into normal control group，COPD model group，azithromycin treatment group.The COPD model was established by the method of cigarette smoking combined with intratracheal injection of LPS.Pathological changes of the bronchi and lung tissues of the rats were observed with HE staining.Pulmonary ventilation function in the rats was detected with pulmonary function instrument.The levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were measured by ELISA.The expression of MUC5ac and TLR4 at mRNA and protein levels in bronchi and lung tissues was determined by real-time PCR and Western blot.RESULTS: HE staining showed that the changes of bronchi and lung tissues in model group were consistent with typical pathological manifestations of COPD.Compared with model group，these changes were alleviated in treatment group.The pulmonary functions in model group were significantly decreased compared with control group.The levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in the BALF in model group were significantly increased compared with control group (P＜0. 05).The expression of MUC5ac and TLR4 at mRNA and protein levels inmodel group was significantly higher than that in control group (P＜0. 05).Compared with model group，the degree of the descent in pulmonary function in treatment group was significantly lessened.Compared with model group，the levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in treatment group were significantly inhibited (P＜0. 05).Furthermore，the expression of MUC5ac and TLR4 at mRNA and protein levels in treatment group was significantly lower than that in model group (P＜0. 05).CONCLUSION: Azithromycin decreases the levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in the BALF of COPD model rats，inhibits the protein expression of MUC5ac and TLR4 in the lung tissues，thus playing a preventive and therapeutic role to reduce airway inflammation and airway mucus hypersecretion.

［KEY WORDS］Chronic obstructive pulmonary disease; Azithromycin; Airway inflammation; Airway mucus hypersecretion

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD;簡稱慢阻肺)是一種慢性呼吸系統疾病，主要以不完全可逆的氣流受限為特征［1］。其氣流受限進行性發展與氣道慢性炎癥反應增強相關。同時合并存在的黏液高分泌亦可導致氣道狹窄，加快肺功能下降進程［2］。患者的不適多表現為慢性咳嗽、咳痰、胸悶氣喘。阿奇霉素是大環內酯類抗生素，有臨床研究發現長期小劑量阿奇霉素口服可預防慢阻肺急性發作，降低患者住院率及死亡率，但具體機制尚不清楚［3］。本研究擬從動物實驗觀察阿奇霉素對慢阻肺的防治作用，并探討其是否可能通過改善氣道炎癥、改善氣道黏液高分泌發揮作用。

材料和方法

1動物

18只雄性SD大鼠購于安徽醫科大學實驗動物管理中心(許可證號SCXK蘇2009-0002)，清潔級，6～8周齡，體重(200±20) g。

2試劑與儀器

阿奇霉素(輝瑞公司) ; LPS(Sigma) ; RSE3020動物肺功能儀器(北京貝蘭博科技有限公司) ; ELISA檢測試劑盒(上海源葉生物技術有限公司) ; RIPA細胞裂解液(上海碧云天生物技術研究所) ; AF-10型自動制冰機(SCOTSMAN) ; JW-3021HR高速臺式冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司) ; TRIzol Reagent(Invitrogen) ;逆轉錄試劑盒(Thermo) ; ABI2720型普通PCR儀(ABI) ; DYY-6B型穩壓穩流電泳儀(北京六一儀器廠) ;熒光定量PCR儀(Thermo)。

3主要方法

3.1大鼠COPD模型的建立SD大鼠標準飼料適應性喂養1周后隨機分為3組:①正常對照(control)組，生理鹽水10 mL·kg－1·d－1灌胃共8周;②慢阻肺模型(model)組:生理鹽水10 mL·kg－1·d－1灌胃4周后，開始造模，造模第1天、第14天，腹腔注射6%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉大鼠，氣管注入LPS 200 μL(1g/L)，第2～28天(第1天、14天除外)每日上午將大鼠置于密封的1 m3煙室中，持續吸入香煙煙霧(滁州煙卷廠生產的紅三環香煙，焦油量19 mg，尼古丁1. 2 mg) 30 min，每天15支，每天熏1次，同時每天繼續生理鹽水灌胃;③阿奇霉素治療(treatment)組，阿奇霉素(8. 3 g/L) 10 mL/kg灌胃4周后，造模方法同前，造模同時每天繼續阿奇霉素灌胃治療。造模4周后，處死大鼠。

3.2大鼠肺功能測定大鼠麻醉后分離暴露氣管，進行氣管插管并固定，用動物呼吸機測定用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、0. 1s用力呼氣容積(forced expiratory volume in 0. 1 second，FEV0. 1)、呼氣峰值流速(peak expiratory flow，PEF)。

3.3大鼠支氣管肺泡灌洗麻醉狀態下測定大鼠肺功能后，迅速打開胸腔，將灌胃針頭從切口處插入氣管，用4 mL生理鹽水灌洗右肺，反復進行3次，共回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)約7 mL，1 500 r/min離心15 min，取上清－20℃保存。

3.4肺組織病理學檢查取右肺組織，置于4%甲醛中固定24 h，常規梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。

當前HSE管理體系得到了企業和社會的共同認可，HSE管理體系建設、體系運行正在成為企業的重要任務。應從HSE管理體系運行的實際出發，以深入剖析、系統研究為基本路徑，找到解決HSE管理體系運行問題和提升HSE管理體系運行效能的策略和方法，實現對HSE管理體系的系統改進和科學優化，在企業管理層面和功能體系上促進企業內在、全面、跨越式地發展。

3.5BALF中IL-8、IL-17和TNF-α含量的測定應用ELISA法進行檢測，嚴格按照操作說明書進行。

3.6Western blot檢測MUC5ac和TLR4的表達取新鮮肺組織，加蛋白裂解液冰上研磨裂解，加入EP管中反復凍融，離心后取上清，BCA法蛋白定量，取蛋白進行SDS-PAGE，電轉至PVDF膜上，分別加I 抗4℃過夜，PBS洗滌3次后，加入相應的II抗，室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，ECL試劑盒顯色，X線膠片曝光。條帶的灰度值用Bio-Rad圖像分析系統測定。

3.7Real-time PCR檢測MUC5ac mRNA和TLR4 mRNA的表達用TRIzol提取肺組織總RNA，使用逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA模板，MUC5ac、TLR4、GAPDH引物序列見表1。按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明設置PCR反應體系，具體如下: 2×SYBR Green Mixture 5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、雙蒸水2 μL。以GAPDH為內參照，上機進行檢測，擴增條件為: 95℃5 min; 95℃10s，60 ℃30 s，40個循環。目的基因的相對表達量采用2－ΔΔCt法計算。

表1　Real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

4統計學處理

采用SPSS 17. 0統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，繼而采用SNK-q檢驗進行兩兩間比較。以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結果

1各組大鼠肺功能的檢測結果比較

治療組肺功能明顯低于對照組，但顯著優于模型組(P＜0. 05)，見表2。

表2　各組大鼠肺功能指標變化Table 2.Changes of lung function indexes (Mean±SD.n =6)

2各組大鼠肺組織病理學改變比較

對照組的支氣管管壁未見增厚，支氣管管壁及肺泡結構完整，纖毛未見脫落;模型組的氣管壁增厚明顯，管腔狹窄，肺泡結構破壞，融合成大皰，上皮細胞大量脫落，纖毛倒伏、脫落明顯，支氣管壁及血管周圍有多種炎性細胞浸潤;治療組的支氣管管壁輕度增厚，管腔可見局部輕度變形，部分肺泡融合，上皮細胞少量脫落，部分纖毛倒伏，支氣管壁及血管周圍可見少量炎性細胞浸潤。模型組的支氣管、肺組織改變符合慢阻肺的病理表現，治療組支氣管肺組織損傷程度輕于模型組，見圖1。

Figure 1.The pathological changes of the rat lung tissues (HE staining，×100).圖1　各組大鼠肺組織病理形態學變化

3大鼠支氣管肺泡灌洗液IL-8、IL-17和TNF-α含量的測定結果

模型組支氣管肺泡灌洗液中IL-8、IL-17和TNF-α含量均顯著高于對照組(P＜0. 05)，而治療組均顯著低于模型組(P＜0. 05)，見表3。

表3　各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-8、IL-17和TNF-α的含量Table 3.The levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in the BALF of the rats (ng/L.Mean±SD.n =6)

4大鼠支氣管肺組織MUC5ac和TLR4蛋白相對表達水平

模型組支氣管肺組織MUC5ac和TLR4蛋白表達水平均顯著高于對照組(P＜0. 05)，而治療組均顯著低于模型組(P＜0. 05)，見圖2。

5大鼠支氣管肺組織MUC5ac和TLR4 mRNA相對表達水平

模型組支氣管肺組織MUC5ac和TLR4的mRNA表達水平均顯著高于對照組(P＜0. 05)，而治療組均顯著低于模型組(P＜0. 05)，見表4。

討論

有研究顯示熏香煙加氣管注入內毒素所致大鼠呼吸系形態和功能的改變，與人類慢阻肺病理改變相符［4］。本實驗通過煙熏和氣管內注入LPS的方法復制慢阻肺大鼠模型。HE染色觀察到慢阻肺組大鼠支氣管壁及血管周圍以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤明顯，上皮細胞可見纖毛倒伏、脫落，杯狀細胞增多，黏液腺體增生，氣管壁膠原纖維顯著增多，管壁增厚伴管腔狹窄，肺組織呈現肺泡結構破壞、肺泡腔擴大、融合成大皰等肺氣腫改變。其肺功能指標下降明顯，提示慢阻肺造模成功。慢阻肺表現氣道慢性炎癥病變，氣道炎癥可致杯狀細胞增生，黏液分泌增加，而黏液分泌增加易繼發感染加重氣道炎癥改變。氣道炎癥和氣道高分泌二者互相影響。有報道顯示大環內酯類抗生素具有一定的抗炎作用［5］，本實驗觀察阿奇霉素治療組大鼠較模型組大鼠病理及肺功能均有明顯改善，提示可能對于慢阻肺有一定的防治作用。

Figure 2.The protein expressions of MUC5ac and TLR4 in the bronchi and lung tissues.Mean±SD.n = 6.*P＜0. 05 vs control group;#P＜0. 05 vs model group.圖2　支氣管肺組織MUC5ac和TLR4蛋白表達變化

表4　各組大鼠支氣管肺組織MUC5ac和TLR4 mRNA的相對表達水平Table 4.The mRNA levels of MUC5ac and TLR4 in bronchi andlung tissues (Mean±SD.n =6)

多項研究表明IL-8和TNF-α在慢阻肺氣道炎癥過程中發揮肯定而重要的作用［6-7］。其作為炎性反應因子，在慢阻肺患者痰液、血液和支氣管肺泡灌洗液中均有顯著升高［8-9］。近年來IL-17在慢阻肺發病研究中受到重視。研究表明IL-17能通過促進IL-8、TNF-α的釋放，使中性粒細胞氣道內聚集增多，參與慢阻肺氣道炎癥［10］。本研究顯示模型組肺泡灌洗液IL-8、IL-17和TNF-α較對照組明顯升高，阿奇霉素治療后相關指標下降，提示阿奇霉素對慢阻肺氣道炎癥的防治效果可能與此作用有關。

吸煙是COPD的主要病因之一，體內外實驗均證實吸煙可促進MUC5ac的合成和分泌［11］。黏蛋白MUC5ac是氣道黏液的主要成分，由杯狀上皮細胞分泌，一些促炎因子如IL-1β、TNF-α，以及細菌毒性產物均可促進其合成［12］。有報道提出慢阻肺患者的氣道中TLR4表達上調，誘導杯狀細胞過度分泌MUC5ac黏蛋白，高黏液分泌狀態導致氣道炎癥反應放大，是慢阻肺進行性發展的重要因素［13］。并且隨著氣道慢性炎癥的長期存在，可誘導小氣道中無黏液分泌功能細胞向黏液上皮細胞轉化，過多黏液分泌加重氣道的狹窄阻塞，加劇肺功能的下降［14-15］。本研究對于TLR4及MUC5ac黏蛋白通過Western blot和real-time PCR方法進行了定性定量分析，結果顯示模型組較對照組大鼠支氣管肺組織蛋白表達水平明顯升高，阿奇霉素治療組各指標較模型組明顯下降。提示阿奇霉素可能通過改善控制氣道黏液高分泌狀態，以達到防治慢阻肺的目的。

慢阻肺發生發展與氣道炎癥、氣道黏液高分泌密切相關。研究指出［16］阿奇霉素可抑制NF-κB表達。NF-κB具備多向調節功能，其作為上游啟動因子涉及到慢阻肺氣道炎癥多個環節。炎癥反應產生、炎癥介質釋放可激活NF-κB，NF-κB激活后進一步促進炎癥介質釋放，如TNF-α、IL-8等。其通過基因轉錄水平上的調控，可產生級聯效應［17］。同時Fujisawa等［18］觀察發現促炎因子IL-1β和IL-17A通過NF-κB通路轉錄機制，調控誘導氣道上皮細胞分泌MUC5ac，提示NF-κB與細胞因子特異性結合，影響氣道MUC5ac表達。TLR-4是病原分子識別受體，激活后可導致IκB磷酸化降解，參與NF-κB的激活［19］，引起核因子κB信號通路開放，誘導氣道MUC5ac表達。阿奇霉素有可能通過NF-κB通路，達到改善氣道炎癥、控制氣道黏液高分泌的作用。

總之，本研究顯示，對于慢阻肺模型大鼠，阿奇霉素能夠減輕慢阻肺相關病理損傷，減緩肺功能的下降，降低肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、TNF-α炎癥因子水平，降低大鼠支氣管肺組織TLR4及MUC5ac黏蛋白表達，說明阿奇霉素有可能通過改善氣道炎癥和氣道黏液高分泌，以達到防治慢阻肺的作用。

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(責任編輯:陳妙玲，余小慧)

Effect of azithromycin on airway inflammation and airway mucus hypersecretion in rats with chronic obstructive pulmonary disease

REN Wei1，2，SUN Geng-yun1，WANG Sheng2，XIONG Ling-ling2，ZHU Chun-dong2，LI Chun-ying2，ZHOU Qun2
(1Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230031，China;2Department of Geriatric Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230022，China.E-mail: sungengyun@tom.com)

R563. 3; R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.10.007

1000-4718(2015)10-1767-05

2015-04-28

2015-08-04

安徽高校省級自然科學研究項目(No.KJ2013Z182)

△Tel: 0551-62922904; E-mail: sungengyun@tom.com