金川多肋牦牛Hoxa6和Hoxa10基因甲基化與mRNA差異表達研究

熊顯榮，張 雁，蘭道亮，李 鍵*，字向東，李善蓉，楊建梅

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041；2.西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041； 3.金川縣獸醫畜牧局，金川 624100)

金川多肋牦牛Hoxa6和Hoxa10基因甲基化與mRNA差異表達研究

熊顯榮1#，張 雁1#，蘭道亮2，李 鍵2*，字向東1，李善蓉3，楊建梅3

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041；2.西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041； 3.金川縣獸醫畜牧局，金川 624100)

本研究旨在通過檢測金川多肋牦牛與普通牦牛中Hoxa6和Hoxa10基因的轉錄水平和啟動子區甲基化狀態，為揭示Hox基因在金川多肋牦牛多1對肋骨性狀形成中的轉錄調控機制奠定基礎。通過實時熒光定量PCR技術檢測Hoxa6和Hoxa10基因在多肋牦牛和普通牦牛中的mRNA表達水平，同時采用重亞硫酸鹽測序PCR(Bisulfite-sequencing PCR，BSP)法對Hoxa6和Hoxa10啟動子區進行甲基化修飾與克隆測序，分析甲基化狀態。結果顯示，多肋牦牛中Hoxa6基因表達量顯著高于普通牦牛(P<0.05)，而Hoxa10基因表達量顯著低于普通牦牛(P<0.05)。Hoxa6啟動子區域的CpG2，在普通牦牛中的DNA甲基化顯著高于多肋牦牛(P<0.05)，尤其是第3、4、8、20和21位CpG位點；Hoxa10啟動子區域的CpG1在普通牦牛中的DNA甲基化狀態顯著低于多肋牦牛(P<0.05)，普通牦牛的第9和12位CpG位點幾乎未甲基化。多肋牦牛中Hoxa10高甲基化在一定程度上抑制了Hoxa10基因的表達，Hoxa6低甲基化水平促進了Hoxa6基因的表達。啟動子區域的甲基化在一定程度上影響Hox基因的轉錄調控，且與多肋性狀的形成可能存在一定的聯系。

牦牛；Hox基因；甲基化；表達

牦牛(Bosgrunniens)是主要分布于中國青藏高原及其毗鄰地區的一個特有且珍貴的畜種，其對高寒草地生態環境具有良好的適應能力，能在低氧、嚴寒、強紫外線輻射的高原惡劣環境條件下生存和繁衍后代，并為當地牧民提供乳、肉等畜產品、作為運輸工具等生產和生活必需品，是當地牧民的主要經濟來源[1]。此外，在遺傳上也是一個極為寶貴的基因庫。目前，依據牦牛的起源地、外貌、形態結構、生產性能、線粒體DNA以及所處地理環境特點，已認定了大通牦牛、天祝牦牛、九龍牦牛、麥洼牦牛等多個地方品種[2]。金川多肋牦牛主要分布于四川省阿壩藏族羌族自治州金川縣，擁有15對肋骨，比普通牦牛多1對肋骨，而且具有產肉、產奶量高，性成熟早、繁殖性能高、遺傳穩定、抗逆性強等優良生產性能和生物學特性[3]。因此，開展金川多肋牦牛遺傳資源的保護與開發具有重要的經濟和科學價值，研究其生長發育及其調控機理對充分發揮優良特性和促進牧區發展具有重要意義。

肋骨數與生產性、抗逆性等密切相關，在多椎骨蒙古羊的研究中也有報道[4]。研究表明，蒙古羊的多椎骨形成與Hox簇(Homeobox)基因有關。Hox簇基因最早在果蠅中發現[5]，是一類專門調控生物體形發育的基因，進化上相對保守，決定著動物的體節與椎骨的位置、形態和數量[6]。大多數脊椎動物的Hox基因有4個連鎖群，即Hoxa、Hoxb、Hoxc、Hoxd，分別位于第7、17、2、12 號染色體上，各自有 13個基因位點[7]。M.Kmita等研究表明，Hoxa和Hoxd 在調節軀體形成中起重要作用，而Hoxb和Hoxc只起細微調節作用[8]。哺乳類動物的細胞分化高度復雜，因此需要4個Hox基因簇以不同形式產生足夠種類的Hox基因組合，但是Hox基因的功能在多大程度上依賴于這種組合仍不確定[9-10]。Hox基因的突變會導致動物脊椎的數量或在不同位置椎骨形態發生變異。小鼠的Hox8突變可導致胸椎增加一枚，并且肋骨多長1對[11-12]；趙靜等研究烏珠穆沁旗蒙古羊時發現，多胸椎蒙古羊的Hoxc8基因表達異常[4]。以上研究結果表明，Hox家簇基因與哺乳動物的體軸骨架以及附屬骨的形成息息相關。此外，以小鼠為模式動物，將Hoxa10基因敲除后發現，腰椎骨消失且肋骨一直延伸到尾椎骨。同時，Hoxa10發生變異后，小鼠的肋骨數也由13對增加到14對，且骶骨的形成過程也發生改變[13]。D.Kostic等研究顯示，雜合的Hoxa6小鼠的椎骨形成異常[14]。然而，有關金川多肋牦牛的形成機制和分子機理至今仍未弄清楚。

DNA甲基化是DNA在復制后由DNA甲基轉移酶(DNA methyl-transferase，Dnmt)催化，將S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉移到胞嘧啶第5位C上而形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。在基因組DNA序列沒有發生改變的情況下，基因表達發生改變且可以遺傳，導致可遺傳的表型變化[15]。DNA甲基化與生物體內重要基因的表達調節有緊密聯系，目前研究結果表明，DNA甲基化一般與基因的表達呈負相關，啟動子區的高甲基化與基因的表達呈負相關，結構基因內部的甲基化與基因表達也存在著一定的負相關，而啟動子區低甲基化與轉錄活性正相關[16]。

因此，本研究以金川多肋牦牛為研究對象，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測Hoxa6和Hoxa10基因在金川多肋牦牛(15對)及普通牦牛(14對)中的表達差異；利用重亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite-sequencing PCR，BSP)檢測金川多肋牦牛中Hoxa6和Hoxa10基因的甲基化狀態，從表觀遺傳學角度分析Hoxa6和Hoxa10基因與金川多肋牦牛的聯系。旨在為進一步揭示Hox基因對金川多肋牦牛生長發育、胚胎骨骼發育等的作用，以及建立有效可靠的分子標記等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DNA提取試劑盒購自Omega公司；膠回收及質粒提取試劑盒購自Axygen公司；Trizol 購自Invitrogen公司；基因組DNA修飾試劑盒購自Gepigentek公司；熒光實時定量PCR儀、電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad公司；引物由上海英駿公司合成。

1.2 試驗動物

牦牛組織樣品均采集于四川省阿壩州金川縣，試驗動物為健康的空懷期成年母牦牛(3歲左右)，屠宰后立即采集普通牦牛和多肋牦牛(各5頭)的血液和組織。采集的血液樣本置于RNA保護液中保存，組織樣品立即置于液氮中保存，用于提取基因組DNA和總RNA。

1.3 基因組DNA的提取

參照說明書，用Tissue DNA Kit(Omega)提取多肋牦牛和普通牦牛基因組DNA，-80 ℃保存備用。

1.4 總RNA的提取及反轉錄

利用Trizol試劑盒提取血液、腎和肺組織樣本的總RNA。并用RNase-free的DNase I處理，以去除DNA污染。RNA的質量和含量通過Nanodrop ND-1000檢測吸光度A260 nm/A280 nm進行測定，完整性通過1.5%(w/v) 凝膠電泳進行檢測。取2 μL(1 μg·μL-1)RNA，0.5 μL M-MLV反轉錄酶，0.5 μL oligo(dT)18，2 μL Buffer，及DEPC水至10 μL，反轉錄成cDNA。

1.5 qRT-PCR 定量分析Hoxa6和Hoxa10表達

本試驗以Hoxa6和Hoxa10為研究對象，以管家基因GAPDH為內參分析目的基因的相對表達水平。根據本課題組前期獲得的RNA序列，用Primer 5.0進行引物設計，引物均需跨內含子設計，具體引物序列見表1。采用SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR法分析多肋牦牛與普通牦牛Hoxa6和Hoxa10基因的mRNA相對表達豐度。所有反應均重復3次，20 μL反應體系：10 μL 2×SYBR Green premix，上、下游引物各0.8 μL(10 pmol·mL-1)，模板2 μL 以及DEPC水6.4 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，最佳Tm 10 s，72 ℃ 10 s，共40個循環。65～95 ℃每隔 0.5 ℃讀板一次，繪制熔解曲線。分析各基因的熔解曲線并電泳鑒定PCR產物。結果采用2-△△Ct法對目的基因mRNA表達水平進行相對定量分析。

1.6Hoxa6和Hoxa10基因5′端序列的克隆

根據NCBI數據庫中已公布牛的Hoxa6(NW_005394721.1)和Hoxa10(NW_005394721.1)基因DNA序列，對目的基因轉錄起始位點(Transcription start sites，TSS)上游2 000 bp設計兩對引物Hoxa6-p和Hoxa10-p，進行PCR擴增。將PCR產物連接到pMD19-T Vector(TaKaRa)載體上，并轉化到感受態細胞DH5α。挑取單克隆進行菌液PCR鑒定，陽性克隆送華大基因公司測序。

1.7 CpG島的預測與引物設計

對目的基因Hoxa6和Hoxa10轉錄起始位點(TSS，+1)前后的序列(-2 000～+2 000 bp)進行甲基化CpG島的預測，預測結果見圖1。在Hoxa6啟動子區域選擇一段長205 bp的CpG2作為研究對象，該區域有21個CpG位點；在Hoxa10啟動子區域選擇一段長177 bp的CpG1作為研究對象，該區域有15個CpG位點；上面一排為目的基因原序列，下面一排為重亞硫酸氫鹽處理后的序列，可見下面一排序列中除CpG位點外的C都轉化為了T，方框區域為引物，具體見圖1。

1.8 DNA 的重亞硫酸鹽處理

采用甲基化試劑盒對DNA進行修飾，詳細步驟參見試劑盒說明書，獲得修飾后的DNA。取修飾后DNA作為模板進行BSP擴增反應，PCR反應體系為50 μL：Zymo TaqTMPremix 25 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，模板4 μL，ddH2O 19 μL。反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，最佳Tm 40 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 7 min；4 ℃ 30 min。將PCR產物連接到pMD19-T Vector載體，并轉化到DH5α感受態細胞。從平板上隨機挑取單克隆進行菌液PCR鑒定，每個轉化板至少挑10個陽性克隆送華大基因公司測序。測序結果通過Bioanalyzer軟件進行處理與分析。

表1 引物序列及 PCR反應條件

Table 1 Primer sequences and PCR reaction conditions

名稱Name引物序列(5′?3′)Primersequence位置/bpPosition產物長度/bpProductsize退火溫度/℃AnnealingtemperatureHoxa6?pF：CTGTCATCTGATGGCGTTGTR：CTGCAGGACTGTGATTTGTTGT-2069～-2050-14～-35205657Hoxa10?pF：TATGGGCTGCAGAGCTGCR：CAGTTGGCTGCGTTTTCG-1980～-196310～-8199057Hoxa6?qF：GGCAGTGGCAAACAGAGGR：CAGGTAGCGGTTGAAGTGG293～310559～54126758Hoxa10?qF：GCCTTTGTTCGCTTCTGATTR：GCGTCTGGTGCTTGGTGTA19～218492～47429457Gapdh?qF：TGGTGCTGAGTATGTGGTGGR：TCTTCTGGGTGGCAGTGATG373～392662～64329059Hoxa6?BF：GTAAAAGGGAAGGAGTAAAGAGR：AAATTACAAACAACCCCCAATC-405～-384-201～-22220554．6Hoxa10?BF：GTAGAATATTAAAGAGGAGAGR：CCCTTAATAATACCATAAACC-1695～-1675-1519～-153917753．4

p.RT-PCR；q.qRT-PCR；B.BSP

p，q and B represent RT-PCR，qRT-PCR and BSP，respectively

1.9 統計與分析

所有組別的試驗都至少重復3次。試驗數據采用SPSS 19.0軟件進行分析。mRNA相對表達豐度等采用ANOVA方差分析和Tukey′s LSD檢驗，所有結果當P<0.05時表示差異有統計學意義。所有數據均采用“平均值±標準誤(mean±SEM)”表示。

圖1 Hoxa6和Hoxa10結構及BSP擴增區域示意圖Fig.1 The schematic diagram of Hoxa6 and Hoxa10 and the regions amplified by BSP

2 結 果

2.1 牦牛Hoxa6和Hoxa10基因 5′端序列特征

以黃牛Hoxa6 (NW_005394721.1)和Hoxa10(NW_005394721.1)基因DNA序列為參照設計引物，分別擴增5′端序列，電泳圖譜如圖2(泳道1、2) 所示。經過克隆測序和序列分析獲得了牦牛Hoxa6和Hoxa10 轉錄起始位點上游部分序列，總長分別為 2 056和1 990 bp，經BLAST分析，與黃牛序列的同源性為97.5%和96.4%。牦牛Hoxa6轉錄起始位點上游部分序列中A、T、G、C等4種堿基的含量分別為 23.2%、24.4%、26.1%和 26.3%，其中A+T含量(47.6%)小于G+C含量(52.4%)。牦牛Hoxa10轉錄起始位點上游部分序列中A、T、G、C等4種堿基的含量分別為24.6%、23.7%、27.0%和 24.7%，其中A+T含量(48.3%)小于G+C含量(51.7%)。

2.2Hoxa6和Hoxa10基因 mRNA表達水平

熒光定量的擴增曲線和熔解曲線見圖3。結果表明，Hoxa6在多肋牦牛中表達量顯著高于普通牦牛(P<0.05)，其中在多肋牦牛的腎中表達量最高。然而，Hoxa10在普通牦牛中表達量顯著高于多肋牦牛(P<0.05)，其中在普通牦牛的肺組織中表達量最高，其次是血液(圖4)。

M1、M2均表示DNA 相對分子質量標準；1.Hoxa6 5′端；2.Hoxa10 5′端；3～12.重亞硫酸鹽處理后的Hoxa6(上)和 Hoxa10(下)亞克隆菌液PCR產物M1 and M2 represent DNA markers；1 and 2 represent the 5′flanking of Hoxa6 and Hoxa10，respectively；3 to 12 represent the subcloning bacteria PCR products of Hoxa6 and Hoxa10 after bisulfite treatment圖2 PCR擴增片段瓊脂糖電泳Fig.2 Representative gel photograph of PCR-amplified fragments

圖3 qRT-PCR的擴增曲線和熔解曲線Fig.3 The amplification and melt curves of qRT-PCR

2.3Hoxa6和Hoxa10基因甲基化水平

經菌液PCR鑒定，陽性克隆(圖2，2～12泳道)進行測序。BSP結果顯示，Hoxa6啟動子區域的CpG2在普通牦牛血液中DNA甲基化狀態(34.76%，73/210)顯著高于多肋牦牛(17.14%，36/210)(P<0.05)，尤其是第3、4、8、20和21 位CpG位點。Hoxa10啟動子區域的CpG1在普通牦牛血液中DNA甲基化狀態(22.0%，33/150)顯著低于多肋牦牛(38.0%，57/150)(P<0.05)，普通牦牛的第9和12位CpG位點幾乎未甲基化，而在多肋牦牛中甲基化程度較高(圖5)。

3 討 論

金川多肋牦牛的多肋性狀具有巨大的應用價值和科學研究意義，但是迄今為止仍未揭開多肋的形成機制以及表觀遺傳。本研究從表觀遺傳和基因表達角度探索金川多肋牦牛的分子發育遺傳機制。結果表明，Hoxa6和Hoxa10在多肋牦牛和普通牦牛之間呈拮抗式表達，而啟動子區域甲基化狀態剛好相反。

*.表示差異顯著*.Represents significant difference圖4 多肋牦牛與普通牦牛組織Hoxa6和Hoxa10基因的表達水平Fig.4 Hoxa6 and Hoxa10 mRNA expression differences between multi-costa and common yaks

(A).Hoxa6和Hoxa10的BSP測序結果圖：每行代表一個克隆，黑圈代表甲基化的 CpG 位點，白圈代表未被甲基化的 CpG 位點。(B).Hoxa6和Hoxa10甲基化統計圖：不同字母(a和b)表示差異顯著(A).Bisulfite sequencing results for multi-costa and common yaks：Each line represents an individual bacterial clone which was sequenced；Filled circles indicate methylated CpG sites；Open circles indicate unmethylated CpG sites.(B).Methylation charts of Hoxa6 and Hoxa10：Different letters(a and b) indicate significant differences圖5 多肋牦牛與普通牦牛血液中 Hoxa6和Hoxa10的甲基化狀態Fig.5 Hoxa6 and Hoxa10 methylation state in blood of multi-costa and common yaks

Hox基因與脊椎動物體軸骨發生及其基因調控機理是從果蠅開始研究的[5]。Hox基因表達模式的建立和維持具有復雜的調控機制，沿染色體的排列順序與沿胚胎前后軸的表達之間存在空間和時間上的共線性關系[17]。Hox基因家簇成員與椎骨形成之間的聯系已陸續的得到研究。利用基因敲除法改變Hox基因的DNA分子的堿基序列，可揭示Hox家簇基因的突變導致動物脊椎不同位置椎骨形態與數量的變異[18-19]。本研究結果顯示，Hoxa6與Hoxa10的表達呈負相關，與T.Vinagre等研究結果一致，Hoxa6和Hoxa10的表達改變，使小鼠出現了肋骨增加或抑制肋骨發育的現象[17]。Hoxa10是通過調控胸廓區域來規劃少了肋骨之后的腰區布局。D.M.Wellik等研究表明，Hoxa10是哺乳動物骨架形成必不可少的基因之一，減少Hoxa10的表達可使小鼠無法形成肋骨[20]。因此推測，Hoxa10表達量的增加可能是金川牦牛形成多肋的原因之一。此外，Hoxa6與Hoxa10的相互作用也有可能使多肋性狀出現。研究表明，Hoxa10和Hoxa6是通過Myf5/Myf6介導的FGF和PDGF信號通路而相互作用的，Myf5/Myf6是通過影響Hoxa10和Hoxa6的表達來控制骨架的形成和肋骨數[17]。然而，是否由于Hoxa10和Hoxa6異常表達引起的金川牦牛多肋現象需進一步深入研究，通過構建敲除細胞系或建立敲除模型驗證Hox基因與金川多肋牦牛的相關性。

DNA甲基化是基因組主要表觀遺傳修飾方式之一，通常參與轉錄調節，并且已知靶序列5′端調控區的超甲基化可能與表達抑制相關，即甲基化程度越高，表達活性越低[21]。CpG島的超甲基化往往會改變基因的表達模式，導致基因的轉錄失活[22-23]。本研究結果表明，金川多肋牦牛Hoxa10的甲基化程度顯著高于普通牦牛，這種超甲基化很可能使控制肋骨的基因表達發生異常，因此導致多肋性狀的出現。此外，Hoxa6在多肋牦牛中的甲基化水平顯著低于普通牦牛，很可能進一步促進肋骨形成基因的轉錄。D.Kostic等用基因敲除試驗表明鼠的Hox6突變可使胸椎增加一個，隨之肋骨也多生一對[14]。Hox11突變則導致鼠的椎骨增加一枚[24]。N.Di-Poi等發現，生長分化因子(GDF)基因可能是Hox8基因上游的調控基因，鼠GDF基因的突變雜合子有 14對肋骨，而突變純合子的胸椎多達 l8 對肋骨，這表明調節主軸骨前后形態的基因不僅僅與Hox基因有關，與其上游調控區域也密切聯系[25]。因此，推測DNA甲基化抑制了Hoxa10基因的表達，以及低甲基化促進了Hoxa6基因的表達，從而使得金川多肋牦牛肋骨數增加一對，而這其中的具體機制還有待于進一步深入研究與驗證。

本研究中，通過初步分析Hoxa6和Hoxa10基因之間的相互平衡關系來探討金川多肋牦牛的多肋生物學現象形成機制。前期大量研究證實了Hoxa6和Hoxa10基因分別與腰區和骶區骨骼形成之間的相關性[17]。本研究結果表明，Hoxa6基因促進椎骨和肋骨的形成，而Hoxa10基因的作用相反。在蒙古羊的研究中發現了明顯的多椎骨現象，且證明與Hox家簇基因有密切聯系[4]。在金川牦牛的屠宰試驗中，我們也發現了類似的生物學現象，有部分牦牛的第15對肋骨只有一側有，另一側沒有，或者兩側的肋骨發育不完全，只有半截。是否由于Hox基因調控椎骨的發育和形成，而間接性的支配肋骨的生長發育還有待進一步挖掘。

4 結 論

本研究利用重亞硫酸氫鹽測序法和實時熒光定量法對Hoxa6和Hoxa10基因在多肋牦牛和普通牦牛中的表達和甲基化水平進行了研究。結果顯示，普通牦牛Hoxa6基因的甲基化水平極顯著高于多肋牦牛，且mRNA 表達水平低于多肋牦牛；多肋牦牛Hoxa10基因的甲基化水平極顯著高于普通牦牛，且mRNA 表達水平低于普通牦牛；說明金川多肋牦牛的Hoxa6和Hoxa10基因可能是通過改變DNA甲基化及其mRNA表達來調控肋骨的形成過程。

[1] QIU Q，ZHANG G J，MA T，et al.The yak genome and adaptation to life at high altitude[J].NatGenet，2012，44：946-949.

[2] WANG Z，SHEN X，LIU B，et al.Phylogeographical analyses of domestic and wild yaks based on mitochondrial DNA：new data and reappraisal[J].JBiogeogr，2010，37：2332-2344.

[3] 李 強，傅昌秀，文勇立，等.金川多肋牦牛體尺和屠宰性狀測定及其相關性分析[J].中國草食動物科學，2012(2)：18-20.

LI Q，FU C X，WEN Y L，et al.Determine body size and carcass traits of multi-costa properties of Jinchuan yak and correlation analysis[J].ChinaHerbivoreScience，2012(2)：18-20.(in Chinese)

[4] ZHAO J，ZHANG L L.The differences of CpG distribution in Hoxc8 among the sheep breeds[C].San Diego：Plant and Animal Genome Conference，2011：15-19.[5] LEWIS E B.A gene complex controlling segmentation in Drosophila[J].Nature，1978，276：565-570.

[6] SIMONA S，BOORE J L，MEYER A.Evolutionary conservation of regulatory elements in vertebrate Hox gene clusters[J].GenomeRes，2003，13(3)：1111-1122.

[7] MACGINNIS W，KRUMLAUF R.Homeobox genes and axial patterning[J].Cell，1992，68：283-302.

[8] KMITA M，DUBOULE D，TARCHINI B.Hox genes and limb morphogenesis[J].DevBiol，2007，306(1)：288-289.

[9] ZAKANY J，DUBOULE D.The role of Hox genes during vertebrate limb development[J].CurrOpinGenetDev，2007，17(4)：359-366.

[10] GIORDANI J，BAJARD L，DEMIGNON J，et al.Six proteins regulate the activation of Myf5 expression in embryonic mouse limbs[J].ProcNatlAcadSci，2007，104：11310-11315.

[11] KONDRASHOV N，PUSIC A，STUMPF C R，et al.Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning[J].Cell，2011，3(28)：383-397.

[12] YOUNG T，ROWLAND J E，DE VEN C，et al.Cdx and Hox genes differentially regulate posterior axial growth in mammalian embryos[J].DevCell，2009，17(4)：516-526.

[13] WELLIK D M，CAPECCHI M R.Hox10 and Hox11 genes are required to globally pattern the mammalian skeleton[J].Science，2003，301：363-367.

[14] KOSTIC D，CAPECCHI M R.Tageted disruptions of the murine Hoxa-4 and Hoxa-6 genes result in homeotic transformation of components of the vertebral column[J].MechDev，1994(4)：231-247.

[15] JONES P A，TAKAI D.The role of DNA methylation in mammalian epigenetics[J].Science，2001，293(5532)：1068-1070.

[16] VAISSIERE T，SAWAN C，HERCEG Z.Epigenetic interplay between histone modifications and DNA methylation in gene silencing[J].MutatRes，2008，659：40-48.

[17] VINAGRE T，MONCAUT N，CARAPUCO M，et al.Evidence for a Myotomal Hox/Myf cascade governing nonautonomous control of rib specification within global vertebral domains[J].DevCell，2010，2(11)：655-661.

[18] MALLO M，WELLIK D M，DESCHAMPS J.Hox genes and regional patterning of the vertebrate body plan[J].DevBiol，2010，344(1)：7-15.

[19] IIMURA T，DENANS N，POURQUIE O.Establishment of Hox vertebral identities in the embryonic spine precursors[J].CurrTopDevBiol，2009，88：201-234.

[20] WELLIK D M，CAPECCHI M R.Hox10 and Hox11 Genes are required to globally pattern the mammalian skeleton[J].Science，2003，301：363-367.

[21] JIANG H，SUN B，WANG W C，et al.Activation of paternally expressed imprinted genes in newly derived germline-competent mouse parthenogenetic embryonic stem cell lines[J].CellRes，2007(17)：792-803.

[22] JACINTO F V，BALLEATAR E，ESTELLER M.Methyl-DNA immunoprecipitation(MeDIP)：hunting down the DNA methylome[J].Biotechniques，2008，44(1)：35-39.

[23] GABORY A，RIPOCHE M A，LE D A，et al.H19 acts as a trans regulator of the imprinted gene network controlling growth in mice[J].Development，2009，136：3413-3421.

[24] DESCHAMPS J，VAN NES J.Developmental regulation of the Hox genes during axial morphogenesis in the mouse[J].Development，2005，132：2931-2942.

[25] DI-POI N，MONTOYA-BURGOS J I，MILLER H，et al.Changes in Hox genes’ structure and function during the evolution of the squamate body plan[J].Nature，2010，464：99-103.

(編輯 郭云雁)

Differences ofHoxa6 andHoxa10 Methylation Status and mRNA Expression in Multi-costa Properties of Jinchuan Yak

XIONG Xian-rong1#，ZHANG Yan1#，LAN Dao-liang2，LI Jian2*，ZI Xiang-dong1， LI Shan-rong3，YANG Jian-mei3

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China； 2.InstituteofQinghai-TibetanPlateau，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China； 3.AnimalHusbandryandVeterinarianBureauofJinchuan，Jinchuan624100，China)

The transcription level and methylation in promoter regions ofHoxa6 andHoxa10 genes in multi-costa properties and common yak were investigated to explore the mechanism of transcriptional regulation ofHoxgene in the process of multi-costa properties.The mRNA expression leves ofHoxa6 andHoxa10 genes in multi-costa properties and common yak were detected by real-time fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR)，and the methylation ofHoxa6 andHoxa10 genes promoter regions were analyzed by bisulfite-sequencing PCR(BSP)，which included modifying，cloning and sequencing the promoter regions.The results showed that the expression level ofHoxa6 gene was significantly higher in multi-costa properties yak than that in common yak(P<0.05)，while the expression level ofHoxa10 gene was significantly lower in multi-costa properties yak(P<0.05).The methylation status of CpG2 island in theHoxa6 promoter region was significantly different between multi-costa properties and common yak，especially on No.3，4，8，20 and 21 CpG sites.However，the methylation status of CpG1 island in theHoxa10 promoter region was significantly higher in multi-costa properties yak than that in common yak(P<0.05)，and there was almost no methylation on No.9 and 12 CpG sites in common yak.All above results suggested that the high DNA hypermethylation ofHoxa10 gene in multi-costa properties yak inhibited the expression ofHoxa10 gene in a certain degree，and the low DNA hypomethylation ofHoxa6 gene enhanced the expression ofHoxa6 gene.It was concluded that methylation inHoxpromoter regions may have some influence on transcription regulation ofHoxgenes，and there may be some correlation with the formation of multi-costa properties.

yak；Hoxgene；methylation；expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.007

2014-11-02

國家科技支撐計劃(2012BAD13B06)；四川省科技支撐計劃(2014NZ0114)；西南民族大學牦牛創新團隊資助(13CXTD01)

熊顯榮(1984-)，男，江西贛州人，碩士，主要從事牦牛細胞生物學和發育生物學研究，E-mail：xianrongxiong@163.com；張 雁(1990-)，女，吉林長春人，碩士，主要從事牦牛遺傳育種研究，E-mail：150115439@qq.com。二者共同并列為第一作者

*通信作者：李 鍵，教授，博士生導師，主要從事牦牛細胞生物學和發育生物學研究，E-mail：jianli_1967@163.com

S823.85；S813.3

A

0366-6964(2015)09-1532-08