爪蟾卵母細胞抽提物可誘導牛胎兒成纖維細胞發生部分重編程

杜衛華，范宗興，王皓宇，郝海生，劉 巖，趙學明，秦 彤，朱化彬

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

爪蟾卵母細胞抽提物可誘導牛胎兒成纖維細胞發生部分重編程

杜衛華，范宗興，王皓宇，郝海生，劉 巖，趙學明，秦 彤，朱化彬*

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

應用非洲爪蟾卵母細胞抽提物處理和牛胎兒成纖維細胞(Japanese Black cattle fetal fibroblasts，JBCFF)，觀察處理前后細胞的形態學變化，同時用免疫熒光染色法檢測組蛋白的乙酰化狀態和OCT4蛋白的表達，并對其多能性標志基因的mRNA表達水平進行定量分析。結果表明，與未處理細胞相比，經抽提物處理和牛胎兒成纖維細胞組蛋白H3K9乙酰化程度與未處理組無顯著差異；培養5～6 d后細胞聚集形成“克隆簇”中堿性磷酸酶和Oct4蛋白染色陽性；同時也檢測到Oct4和Nanog基因在其中的表達，而Sox2基因未見表達；且Oct4、Nanog基因表達量隨處理后細胞培養時間的延長(4、5、6 d)而呈依次上升趨勢。可見，爪蟾卵母細胞抽提物能誘導和牛胎兒成纖維細胞發生部分重編程，恢復其發育全能性，這對牛誘導性干細胞制備方法的探索和體細胞克隆及轉基因克隆牛效率的提高具有一定的借鑒意義。

爪蟾；卵母細胞抽提物；牛胎兒成纖維細胞；重編程；多能性基因

細胞抽提物誘導是近年來發展迅速的一種體細胞重編程方法，其利用卵母細胞、干細胞或不同類型細胞的提取物誘導體細胞，使其發生重編程，恢復部分全能性或表現其他細胞類型的典型特征[1]。N.Kikyo等[2]用非洲爪蟾(Xenopuslaevis)卵母細胞抽提物處理爪蟾上皮細胞，發現體細胞的蛋白組成發生變化，以TATA盒結合蛋白為代表的一類蛋白從細胞中擦除，以OCR2為代表的抽提物特有蛋白整合入體細胞內，自此開創了抽提物誘導體細胞重編程研究的先河。用非洲爪蟾卵母細胞抽提物處理人239T細胞[3]、豬[4]和小鼠[5-6]胎兒成纖維細胞時，均發現多能性標志基因Oct4和Sox2表達，爪蟾特有的組蛋白B4和核纖層蛋白III整合到體細胞中，體細胞本身的組蛋白H3K9去乙酰化，并形成類胚胎干細胞樣的“克隆簇”，發生部分重編程。另外，蠑螈卵母細胞抽提物也能使體細胞發生同樣變化，具有去分化恢復多能性的趨勢[7]；西伯利亞鱘卵母細胞抽提物處理能誘導豬胎兒成纖維細胞中H3K9的甲基化水平降低和組蛋白乙酰化水平升高[8]。Y.Liu等[9]研究發現爪蟾卵母細胞抽提物誘導供體細胞重編程后形成的“克隆簇”細胞，且該細胞顯著提高克隆胚胎的囊胚發育率[10]。來自兩棲動物卵母細胞或激活后牛卵母細胞的抽提物可誘導乳腺癌細胞重編程，引起腫瘤抑制基因啟動子去甲基化，使沉默基因重新表達，為癌癥的治療提供了新思路[11-12]。

哺乳動物卵母細胞也常用于同種屬間的重編程研究，小鼠卵母細胞抽提物處理體細胞后，細胞核重塑，H3K9完全去甲基化，H3K9、H3K14部分乙酰化；且重編程后的體細胞有助于后續克隆胚胎的發育[13]。豬GV期卵母細胞抽提物可誘導激活多能性標志基因的表達，細胞呈“克隆樣”生長，并能在體內或體外發育為3個原始胚層[14]；而MⅡ卵母細胞抽提物則引起H3K9去乙酰化和TATA框結合蛋白的消失，卻沒有明顯的形態學變化，說明GV期和MⅡ期卵母細胞都具有誘導體細胞重編程能力，但其中不同的因子發揮不同的作用[15]。抽提物誘導重編程方法操作簡便，不僅可以獲得所需類型的細胞，而且抽提物作為脫離細胞的獨立成分，更宜于重編程相關因子的識別，探求重編程的機制。

目前抽提物誘導體細胞重編程的機制尚未明確，而對大家畜，牛體細胞重編程的研究仍鮮有報道。本研究利用非洲爪蟾卵母細胞抽提物與和牛胎兒成纖維細胞共孵育，誘導和牛胎兒成纖維細胞重編程，探索牛iPS細胞的重編程方法，為體細胞克隆牛和轉基因牛生產效率的提高奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

性成熟非洲爪蟾來源于中國科學院遺傳發育研究所動物實驗中心。

1.2 和牛胎兒成纖維細胞的建立和培養

取妊娠40日齡的和牛胎兒，去頭尾、四肢和內臟后將軀干組織采用貼壁法建立成纖維細胞系。將組織塊剪切成碎沫，移至培養瓶底壁并分散均勻，倒置培養瓶，旋緊瓶蓋倒置于37.5 ℃的CO2培養箱中6～8 h；加入常規培養液(含20% FBS的DMEM)，輕輕翻轉培養瓶，讓培養液浸潤組織塊，置培養箱培養；當有鋪滿瓶底50%以上成纖維細胞爬出，用0.25%胰蛋白酶(0.02% EDTA)消化傳代或凍存。

1.3 爪蟾卵母細胞抽提物的提取

選擇性成熟雌性非洲爪蟾，背部淋巴囊處淺表注射PMSG(1 IU·μL-1)100 μL，提取抽提物前1 d，同一位置注射HCG(5 IU·μL-1)100 μL，16～22 h后，收集卵母細胞。挑選輪廓清晰、形態統一的卵母細胞，添加2%半胱氨酸，去除卵膠膜；移除膠膜液，用0.25×MMR漂洗3次，1×MMR(100 mmol·L-1NaCl+2 mmol·L-1KCl+1 mmol·L-1MgSO4+ 2 mmol·L-1CaCl2+0.1 mmol·L-1EDTA+5 mmol·L-1Hepes)漂洗1次；細胞裂解液(2.5 mmol·L-1MgCl2+ 50 mmol·L-1KCl+10 mmol·L-1Hepes+250 mmol·L-1Sucrose)漂洗2次后，將卵移入含1 mmol·L-1二巰基蘇糖醇和1 mmol·L-1蛋白酶抑制劑的細胞裂解液中；800 r·min-1離心10～15 s，移去裂解液；添加抑酶肽、亮肽素、蛋白酶抑制劑(終濃度5 μg·mL-1)到卵頂部；4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min后，液體分為3層，抽取中間層粗提物至預冷的離心管中；再次添加抑酶肽、亮肽素、蛋白酶抑制劑到卵頂部(終濃度5 μg·mL-1)，4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，同樣移出抽提物至預冷離心管，添加甘油，4 ℃混勻后分裝，液氮冷凍，保存于-80 ℃備用。

1.4 爪蟾卵母細胞抽提物處理JBCFF

將生長良好的第4代JBCFF接種于24孔板中，至50%～60%匯片時，用預冷的PBS清洗后添加濃度為7 μg·mL-1的digitonin溶液200 μL·孔-1，迅速冰上作用2 min；預冷的PBS清洗后，添加包含ATP-再生體系的爪蟾卵母細胞抽提物250 μL·孔-1，23 ℃條件下與細胞共孵育1 h；吸去抽提物，加入含2 mmol·L-1CaCl2的常規培養液，孵育2 h后移除封閉液，分別于常規培養液(DMEM+10% FBS)或干細胞培養液(0.1 mmol·L-12-巰基乙醇+1% MEM/NEAA+1 mmol·L-1谷氨酰胺+0.3 μmol·L-1核苷酸+103IU·mL-1LIF+5% FBS+10% 血清替代物+1% 青鏈霉素+ DMEM)中繼續培養，隔天換液以清除死細胞。

1.5 組蛋白H3K9和Oct4免疫熒光染色

經過抽提物處理和未處理的JBCFF(同一來源、同一代數)分別于干細胞培養液中孵育24 h后，分別進行其組蛋白H3K9和Oct4免疫熒光染色。吸除培養液，加入4%多聚甲醛，室溫固定20 min；清洗3次，含0.5% TritonX-100的PBS與細胞共孵育30 min；10%山羊血清封閉細胞30 min后，于兔抗H3K9的多抗(1∶200稀釋于含1% BSA的PBS)中室溫孵育1 h；清洗后，室溫下于FITC標記的山羊抗兔IgG(1∶200稀釋于1% BSA的PBS)避光放置1 h；然后用10 μg·mL-1的PI室溫作用5 min，在熒光顯微鏡下觀察。試驗重復3次，每次隨機選取3個視野拍照，并用Image-pro Plus軟件分析結果。Oct4蛋白的免疫熒光染色，一抗為兔抗Oct4多抗(1∶100稀釋于含1% BSA的PBS)其余則與H3K9染色相同。

1.6 堿性磷酸酶染色

經過抽提物處理和未處理的JBCFF(同一來源、同一代數)，分別置于常規培養液和干細胞培養液中培養6～7 d后，進行堿性磷酸酶染色。細胞經PBS清洗后，加入4%多聚甲醛，室溫固定30 min；清洗后加入500 μL BCIP/NBT染色工作液，室溫避光染色30 min；移除染色液，PBS清洗2～3次，鏡下觀察，拍照。

1.7 抽提物處理細胞中多能性相關基因的PCR和qPCR檢測

以抽提物處理后6 d形成“克隆簇”的細胞為試驗組，抽提物處理后用常規培養液培養的細胞、未處理的JBCFF(同一來源、同一代數)分別置于常規培養液和干細胞培養液中培養6 d后，均作為對照組進行PCR反應。多能性標志基因Oct4、Sox2、Nanog為目標基因，GAPDH為內參基因。參考GenBank中牛(Bostaurus)Oct4基因序列(NM_174580.2)、Sox2基因序列(NM_001105463.1)、Nanog基因序列(NM_001025344.1)和GAPDH基因序列(NM_001034034)，采用primer 5.0軟件設計引物(表1)。采用20 μL擴增體系，PCR條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環。2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產物。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因Genes引物序列(5′?3′)Primersequences產物大小/bpProductsizeOct4F：ACAATTTGCCAAGCTCCTAAAG，R：TCTCACTCGGTTCTCGATACT285Sox2F：CGGCAACCAGAAGAACAG，R：AATCCGGGTGTTCCTTCAT231NanogF：ACACCCTCGACACGGACACT，R：TGACCGGGACCGTCTCTTC146GAPDHF：GCAAGTTCAACGGCACAG，R：GTTCACGCCCATCACAA253

選擇抽提物處理4、5、6 d的JBCFF進行多能性基因Oct4和Nanog實時熒光定量PCR檢測。分別提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行梯度稀釋后選定最佳模板濃度，以牛GAPDH基因為內參，進行qPCR，測定Oct4、Nanog表達水平。按照ABI定量試劑說明書，反應體系20 μL，反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s ，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s， 40個循環。利用7500 System SDS軟件(V 1.4.0)，根據2-ΔΔCT方法，對定量結果進行分析。

2 結 果

2.1 JBCFF系的建立和培養

采用組織塊貼壁法建立JBCFF系，組織塊貼壁1～2 d后，可見零星細胞從組織塊周邊爬出(圖1A)，4～5 d后大量成纖維細胞長出，同時伴隨有少量上皮細胞出現，6～7 d細胞至70%～80%匯合時傳代。根據成纖維細胞與上皮細胞對胰蛋白酶的敏感性不同，經傳代培養逐漸純化，獲得純化的JBCFF(圖1B)。

2.2 爪蟾卵母細胞抽提物處理后JBCFF形態變化

選擇7 μg·mL-1digitonin處理JBCFF(圖2A)，透化后細胞表面可見大量黑點(圖2B)，抽提物處理后細胞稍有回縮，但形態正常，肉眼可見20%～30%細胞死亡或脫落(圖2C)。繼續培養2～3d后，細胞狀態恢復，開始快速增殖，4～5 d細胞開始聚集生長，6～7 d細胞形成“克隆簇”(圖2D)。對照組，未處理細胞(同一來源、同一代數)在干細胞培養液中(圖2E)和常規培養液培養(圖2G)后，以及抽提物處理細胞經常規培養液培養后(圖2F)，均正常生長，未見細胞聚集，成簇生長。

A.組織塊貼壁長出的原代細胞；B.第5代和牛胎兒成纖維細胞A.Primary cells around the bovine fetal tissue；B.F5 JBCFF圖1 和牛胎兒成纖維細胞(JBCFF) 100×Fig.1 The construction of Japanese Black cattle fetal fibroblasts 100×

A.抽提物處理前細胞；B.抽提物處理中細胞；C.抽提物處理后細胞；D.抽提物處理后6 d 細胞形成“克隆簇”；E.干細胞培養液培養6 d的未處理細胞；F.常規培養液培養6 d的抽提物處理細胞；G.常規培養液培養6 d的未處理細胞A.JBCFF before extracts treatment；B.JBCFF during the treatment with extracts；C.JBCFF after extracts treatment；D.Cells colony formed 6 days after extracts treatment；E.JBCFF without extracts treatment cultured with stem cell medium for 6 days as control；F.JBCFF treated with extracts and cultured with common cell medium for 6 days as control；G.JBCFF without extracts treatment cultured with common cell medium for 6 days as control圖2 爪蟾卵母細胞抽提物處理的JBCFF 100×Fig.2 JBCFF treated with Xenopus laevis oocytes extracts 100×

2.3 爪蟾卵母細胞抽提物處理后JBCFF的組蛋白H3K9免疫熒光染色

組蛋白H3K9染色結果表明(圖3)，經抽提物處理后的JBCFF在干細胞培養液中培養24 h后，其組蛋白H3K9乙酰化程度(H3K9相對表達量(263±0.26))低于未經抽提物處理的對照組(295±1.31)，但二者差異不顯著(P>0.05)。

2.4 抽提物處理后JBCFF的堿性磷酸酶染色

抽提物處理6 d后，JBCFF成簇生長(圖4A)；堿性磷酸酶染色后“克隆簇”呈陽性(圖4B)，而其它未形成克隆簇的細胞幾乎沒有著色，呈陰性。而3個對照組細胞(干細胞培養液培養的抽提物未處理細胞、常規培養液培養的抽提物處理和未處理細胞)，則染色呈陰性(圖4C、D、E)。

A.經抽提物處理的JBCFF；B.經抽提物處理JBCFF的組蛋白H3K9熒光染色；C.經抽提物處理的JBCFF細胞核PI染色；D.普通光下的抽提物未處理的JBCFF；E.抽提物未處理JBCFF的組蛋白H3K9熒光染色；F.抽提物未處理的JBCFF細胞核PI染色A.JBCFF treated with extracts；B.H3K9 immunofluorescence staining of JBCFF treated with extracts；C.PI staining of JBCFF treated with extracts；D.JBCFF untreated with extracts；E.H3K9 immunofluorescence staining of JBCFF without treatment extracts；F.PI staining of JBCFF without treatment of extracts圖3 JBCFF的H3K9免疫熒光染色100×Fig.3 JBCFF with H3K9 Immunofluorescence 100×

A.抽提物處理后6 d細胞形成“克隆簇”；B.“克隆簇”細胞堿性磷酸酶染色陽性；C.干細胞培養液培養的抽提物未處理細胞堿性磷酸酶陰性；D.常規培養液培養的抽提物處理細胞堿性磷酸酶染色陰性；E.常規培養液培養的抽提物未處理細胞堿性磷酸酶陰性A.JBCFF colony formed 6 days after extracts treatment；B.Positive reaction of cell colony with alkaline phosphatase staining；C.Negative reaction of JBCFF without extracts treatment cultured with stem cell medium for 6 days as control；D.Negative reaction of JBCFF treated with extracts and cultured with common cell medium for 6 days as control；E.Negative reaction of JBCFF without extracts treatment cultured with common cell medium for 6 days as control圖4 JBCFF堿性磷酸酶染色100×Fig.4 JBCFF stained with alkaline phosphatase 100×

2.5 Oct4蛋白的表達分析

抽提物處理6 d后，和牛胎兒成纖維細胞成簇生長(圖5A)；Oct4免疫熒光染色發現，“克隆簇”呈綠色，染色呈陽性(圖5B)，而其它未形成克隆簇細胞沒有著色，染色呈陰性(圖5D、E)。經干細胞培養液和常規培養液培養的同一來源、同時培養的未處理細胞Oct4免疫熒光染色未著色，染色結果呈陰性。

2.6 爪蟾卵母細胞抽提物處理細胞中多能性相關基因的表達檢測

采用RT-PCR檢測試驗組和對照組細胞中多能性標志基因Oct4、Sox2、Nanog的表達情況，結果顯示，抽提物處理后6 d形成“克隆簇”的細胞有Oct4、Nanog基因表達，Sox2基因未見表達，對照組均無上述基因表達(圖6)，說明抽提物處理和牛胎兒成纖維細胞經過重編程，具有干細胞的多能性。

收集抽提物處理后4、5和6 d的細胞，采用定量PCR檢測Oct4、Nanog基因的表達水平，結果表明，處理后5 d的細胞中Oct4表達量顯著高于處理后4 d細胞(P<0.05，圖8)；Nanog基因表達量也升高，但差異不顯著(P>0.05，表2)。而處理后6 d細胞中Oct4和Nanog基因的表達量均極顯著高于其它兩組(P<0.01，表2)。

A.抽提物處理6 d細胞形成“克隆簇”；B.“克隆簇”細胞中Oct4免疫熒光染色陽性；C.“克隆簇”細胞的細胞核PI染色；D.未處理細胞6 d未形成“克隆簇”；E.非“克隆簇”細胞中Oct4免疫熒光染色陰性；F.非“克隆簇”細胞的細胞核PI染色A.JBCFF colony formed 6 days after extracts treatment；B.Oct4 immunofluorescence staining of JBCFF treated with extracts；C.PI staining of JBCFF treated with extracts；D.JBCFF untreated with extracts without formation of colony；E.Oct4 immunofluorescence staining of JBCFF without colony formation；F.PI staining of JBCFF without colony formation圖5 胎兒成纖維細胞Oct4免疫熒光染色100×Fig.5 JBCFF stained with Oct4 immunofluorescence 100×

表2 抽提物處理后不同天數的JBCFF中Oct4和Nanog基因表達

Table 2 Expression level ofOct4 andNanoggenes in JBCFF treated with extracts at different days

培養天數/dDaysOct4Nanog41．8±2．01a0．9±0．64a54．3±1．58b1．2±2．17a6145．1±1．24A16．2±3．21A

a、b.P<0.05；A.P<0.01

3 討 論

A.抽提物處理后6 d形成“克隆簇”細胞；B.常規培養液培養的抽提物處理細胞；C.干細胞培養液培養的抽提物未處理細胞；D.常規培養液培養的抽提物未處理細胞A.JBCFF colony formed 6 days after extracts treatment；B.JBCFF treated with extracts and cultured with common cell medium for 6 days as control；C.JBCFF without extracts treatment cultured with stem cell medium for 6 days as control；D.JBCFF without extracts treatment cultured with common cell medium for 6 days as control圖6 抽提物處理細胞中Oct4和Nanog基因的RT-PCR檢測Fig.6 Expression analysis of Oct4 and Nanog genes in JBCFF treated with extracts by RT-PCR

體細胞重編程是指通過一定方法將已分化的體細胞逆轉回原始多能狀態，獲得的多能性細胞有巨大的分化潛力，在再生醫學研究方面有巨大的應用前景。研究表明，卵母細胞或干細胞中存在某些因子可誘導體細胞恢復發育全能性，因此其提取物可用于體外誘導體細胞發生重編程[16]。細胞抽提物早期用于真核生物DNA復制、染色質重塑研究[17-19]，而現在抽提物被廣泛用于體細胞重編程[13，20-23]和提高體細胞克隆效率[24]的研究。非洲爪蟾卵母細胞因其體積大、易于獲得、抽提物制備方便而成為研究抽提物誘導體細胞重編程的首選材料[3，9，11，15，25]。本文利用爪蟾卵母細胞抽提物誘導JBCFF重編程，旨在獲得重編程細胞系，為后續體細胞克隆提供試驗材料，同時為研究體細胞重編程的分子機制提供試驗基礎。本研究參考相關文獻[4，9]，選擇適合非洲爪蟾細胞生長的23 ℃為處理溫度，處理時間為1 h，處理完畢后添加含Ca2+的培養基以封閉細胞膜上透化過程中形成的可逆孔道，處理后的體細胞形態正常，生長良好，初步建立了穩定的抽提物處理體系，然后對處理后的體細胞進行重編程能力的相關檢測。

組蛋白H3K9是表觀遺傳修飾的重要位點，H3K9去乙酰化往往與異染色質形成和抑制基因轉錄活性相關[26]。在爪蟾胚胎發育中，去乙酰化發生在母源積累的核心組蛋白整合到胚胎染色質上，胚胎發育階段的去乙酰化被認為是細胞重新分化的必要準備[27]，本試驗中非洲爪蟾卵母細胞抽提物處理的JBCFF，培養24 h后檢測到其組蛋白H3K9的乙酰化程度與未處理組間差異不顯著，而X.R.Xiong等[28]認為牛卵母細胞抽提物能誘導牦牛成纖維細胞中H3K9乙酰化程度升高，該結果的不同可能與卵母細胞抽提物的來源、抽提物供體與受體細胞間種屬的差異等因素有關，因此還需要進一步研究。

抽提物處理的細胞用干細胞培養基培養4～5 d后，細胞開始聚集生長，6～7 d形成“克隆簇”，同時“克隆簇”對堿性磷酸酶染色呈陽性，而同樣培養條件下未處理的體細胞未見形態學改變，該結果與文獻[3-4，10，20]等一致。細胞成簇生長被認為是干細胞和誘導性多潛能干細胞的典型特征，因此本研究中JBCFF經爪蟾卵母細胞抽提物處理后形成的“克隆簇”呈現出一定的干細胞特征。然而同一條件下，未成簇生長的細胞染色呈陰性，說明同種細胞、不同個體的重編程能力有所不同。同類研究中，也有未見“克隆簇”樣細胞形成的報道[9，22，25]，推測可能是由于不同的細胞類型、培養條件和處理體系導致細胞間重編程能力的差異，造成試驗結果不同。

Oct4、Sox2、Nanog是保證多能性細胞自我更新和維持未分化狀態最重要的3個因子，Oct4通過激活或抑制多種基因表達來實現對細胞多能性的維護，Sox2可維持Oct4的表達量，與Oct4共同發揮作用，Nanog功能與Oct4類似，主要是幫助細胞獲得多能性。最近有研究表明Nanog對于誘導牛iPS細胞至關重要[29]，因此推測Nanog基因對維持牛細胞多能性有突出作用，因而被認為是干細胞的多能性標記物，本研究對這3個基因的表達檢測發現，形成“克隆簇”細胞表達Oct4、Nanog，并且熒光染色檢測到Oct4蛋白的表達；未形成克隆簇細胞和未處理細胞均未見上述基因和蛋白的表達；該結果與O.Ganier等[5]和S.Em等[30]的研究結果相似，說明JBCFF經抽提物處理后發生重編程，恢復部分全能性。但是，“克隆簇”細胞中未檢測到Sox2基因的表達，與文獻[4，9，31]的研究不同，可能是由于不同細胞類型重編程能力不同，或是抽提物處理體系不同所致。進一步采用實時熒光定量PCR檢測抽提物處理后不同天數(4、5、6 d)的細胞中Oct4、Nanog基因的表達量變化，發現其隨著培養天數增加表達量呈上升趨勢，這與“克隆簇”生長狀態一致，形成“克隆簇”的細胞被重編程恢復到部分多能狀態，隨著形成“克隆簇”細胞數量的增加，多能性標志基因Oct4、Nanog的表達量也隨著升高。

綜上表明，本研究應用爪蟾卵母細胞抽提物處理和牛胎兒成纖維細胞，誘導了體細胞重編程，使細胞恢復到較低的分化狀態，其中形成“克隆簇”的細胞可能是重編程效果較好的細胞。

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(編輯 程金華)

Reprogramming of Japanese Black Cattle Fetal Fibroblasts Treated withXenopuslaevisOocytes Extracts

DU Wei-hua，FAN Zong-xing，WANG Hao-yu，HAO Hai-sheng， LIU Yan，ZHAO Xue-ming，QIN Tong，ZHU Hua-bin*

(InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

In order to reprogram the Japanese Black cattle fetal fibroblasts(JBCFF)，theXenopuslaevisoocyte extracts was used to incubation with the cells in present study.After 24 hours of culture in medium，there was no significant difference in acetylation of histone H3K9 between the JBCFF treated with extracts and the cells untreated by immunofluorescence assay.The well-defined colony structures of JBCFF treated with extracts were formed with the continuous culture for 5-6 d and the alkaline phosphatase staining of the cells colony was positive.Similarly，the OCT4 protein was detected in the cells colony.Additionally，Oct4 andNanogmRNA expression，two pluripotency marker genes，were detected in those cells by RT-PCR，butSox2 gene expression was not detected.Furthermore，qPCR results showed that the expression levels ofOct4 andNanoggenes in colony cells increased with days of culture(4，5，6 d ) after extracts treatment.In conclusion，theXenopuslaevisoocyte extracts could induce the partial reprogramming of the JBCFF into a low differentiated state.

Xenopuslaevis；oocyte extract；bovine fetal fibroblast；reprogramming；pluripotency marker genes

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.009

2015-01-26

基本科研業務費重點項目(2013ywf-zd-2)；國家科技支撐項目(2012BAD12B01-2)；家畜胚胎工程與繁殖創新團隊(ASTIP-IAS06-2015)

杜衛華(1974-)，女，山西晉中人，博士，副研究員，主要從事家畜胚胎工程研究，E-mail：dwh@iascaas.net.cn

*通信作者：朱化彬，博士，研究員，E-mail：zhuhuabin@caas.cn

S823.2

A

0366-6964(2015)09-1549-08