中國部分主要養(yǎng)蜂區(qū)侵染西方蜜蜂(Apismellifera)群微孢子蟲種質(zhì)分布調(diào)查

張建燕，刁青云，代平禮，褚艷娜，吳艷艷，周 婷，王 強(qiáng)

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所/農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100093)

中國部分主要養(yǎng)蜂區(qū)侵染西方蜜蜂(Apismellifera)群微孢子蟲種質(zhì)分布調(diào)查

張建燕，刁青云，代平禮，褚艷娜，吳艷艷，周 婷，王 強(qiáng)*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所/農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100093)

為了探明中國主要養(yǎng)蜂地區(qū)蜜蜂微孢子蟲的種類及分布，采用多重PCR的方法對(duì)采自中國部分主要養(yǎng)蜂地區(qū)的68份蜜蜂樣品中含有的微孢子蟲進(jìn)行種類鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣本中僅采自山東壽光的樣品中檢測出蜜蜂微孢子蟲(Nosemaapis)，其他所有樣品均只檢測出東方蜜蜂微孢子蟲(Nosemaceranae)的存在。初步推斷在中國主要養(yǎng)蜂地區(qū)寄生危害西方蜜蜂的微孢子蟲種類主要是東方蜜蜂微孢子蟲，該結(jié)果為微孢子蟲病在中國的流行規(guī)律及防治研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

西方蜜蜂；微孢子蟲；多重PCR；種群分布

蜜蜂微孢子蟲病是危害西方蜜蜂的主要病蟲害[1]，主要侵染成年蜜蜂的中腸細(xì)胞[2-3]，可以造成蜜蜂個(gè)體生理及行為上的異常并導(dǎo)致蜜蜂個(gè)體壽命縮短[4-5]。目前已知能夠侵染蜜蜂并造成危害的微孢子蟲種類有蜜蜂微孢子蟲(Nosemaapis)以及東方蜜蜂微孢子蟲(Nosemaceranae)[6]。

自2006年起陸續(xù)有研究人員在歐洲、美洲及臺(tái)灣等地區(qū)發(fā)現(xiàn)西方蜜蜂群(Apismellifera)被東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)侵染的現(xiàn)象[7-9]，尤其近些年的研究發(fā)現(xiàn)在許多國家或地區(qū)西方蜜蜂群(A.mellifera)中東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)有逐漸取代蜜蜂孢子蟲(N.apis)成為主要病原種的趨勢[6，10-13]。由于東方蜜蜂微孢子蟲對(duì)西方蜜蜂具有相對(duì)更強(qiáng)的侵染性和致病性[3]，越來越多的研究人員傾向于認(rèn)為東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)是造成近些年歐美地區(qū)西方蜜蜂大面積死亡的一個(gè)重要原因[1，5，14-16]。鑒于此，調(diào)查不同地區(qū)蜜蜂群中微孢子蟲的種群分布陸續(xù)成為各國的研究熱點(diǎn)[17-22]。本試驗(yàn)試圖參考國外成熟的微孢子蟲種群鑒定技術(shù)，對(duì)采自中國主要養(yǎng)蜂地區(qū)發(fā)生的微孢子蟲樣本進(jìn)行種質(zhì)鑒定，初步明確目前中國發(fā)生與流行的蜜蜂微孢子蟲種類，從而為蜜蜂微孢子蟲在中國的流行規(guī)律研究及防治工作奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2013年，項(xiàng)目組先期與全國主要西方蜜蜂養(yǎng)蜂機(jī)構(gòu)聯(lián)合建立病害監(jiān)測點(diǎn)，一旦發(fā)現(xiàn)疫情即由當(dāng)?shù)卣{(diào)查取樣，選取代表性蜂場從患病蜂群中采集有典型癥狀的病蜂樣品，所有樣品經(jīng)顯微鏡檢測是否含有微孢子蟲。先后收集的含有微孢子蟲病蜂樣品地理覆蓋范圍包括了我國16個(gè)主要養(yǎng)蜂地區(qū)，具體采集地點(diǎn)及時(shí)間信息見表1。

1.2 DNA提取

參照M.M.Hamiduzzaman等[19]的HBRC法對(duì)蜜蜂及孢子蟲的DNA進(jìn)行提取并加以改進(jìn)，從每份樣品中取鏡檢感染有孢子蟲的蜜蜂，將蜜蜂腹部分別液氮凍磨并勻漿，加入300 μL的提取液及4 μL蛋白酶K溶液(20 mg·mL-1)，60 ℃水浴3 h，水浴后加入等體積(300 μL)的苯酚∶氯仿(1∶1)混合液，并輕輕混勻；13 000 r·min-1條件下離心15 min，將上清液移至另一個(gè)新管中，再次加入等體積(300 μL)的苯酚∶氯仿(1∶1)混合液，并輕輕混勻，同樣條件下離心，取上清，向上清液中加入等體積(300 μL)的氯仿并輕輕混勻，13 000 r·min-1條件下離心5 min，將上清液(300 μL)移至新管中，加入預(yù)冷的2倍體積(600 μL)的95%乙醇和1/10體積(30 μL)的3 mol·L-1NaOAc，輕輕混勻，-20 ℃過夜沉淀，10 000 r·min-1離心15 min，移去上清，沉淀用1 mL的70%乙醇洗滌2次，烘干后加入20 μL的ddH2O，置于65 ℃的條件下水浴10 min，輕輕溶解，混勻每個(gè)管中的沉淀物，10 000 r·min-1條件下離心10 s，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增

引物、擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)步驟均參照M.M.Hamiduzzaman等[19]所設(shè)計(jì)并經(jīng)驗(yàn)證的蜜蜂微孢子蟲鑒定方法。用所提取的DNA樣品在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)和蜜蜂微孢子蟲(N.apis)的16S rRNA以及蜜蜂的β-actin基因的共擴(kuò)增反應(yīng)。

20 μL PCR反應(yīng)體系：Mix(Promega公司)10 μL，10 μmol·L-1引物(3對(duì)，表2)4.8 μL，5 ng·μL-1DNA模板1.0 μL，ddH2O 4.2 μL。

反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)：94 ℃2.5 min；94 ℃15 s，61.8 ℃條件下30 s，72 ℃條件下45 s， 16個(gè)循環(huán)；94 ℃15 s，61.8 ℃30 s，72 ℃50 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的分離

擴(kuò)增產(chǎn)物用50和100 bp的ladder以及2.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，120 V電壓下進(jìn)行32 min，用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行成像及分析。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的測序

將檢測結(jié)果中218 bp的N.ceranae條帶和321 bp的N.apis條帶進(jìn)行測序(華大基因)，利用NCBI中的BLAST軟件將條帶測序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的序列信息進(jìn)行同源性比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1 所有樣品種質(zhì)鑒定

對(duì)所有采集的樣品進(jìn)行微孢子蟲鏡檢，鏡檢含有微孢子蟲的樣品68份，對(duì)所有68份樣品以蜜蜂基因組與微孢子蟲基因組為模板，采用蜜蜂看家基因(β-actin)、東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)和蜜蜂微孢子蟲(N.Apis)16S rRNA特異序列所對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，所有的68份樣品均檢測到了微孢子蟲條帶，檢出率為100%。其中僅從采自山東壽光的樣品中檢測到了蜜蜂孢子蟲(N.Apis)，占所有樣品的1.5%，其他所有樣品均僅檢測出東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)，占所有樣品的98.5%，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1、2所示。

2.1.1 東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)檢測結(jié)果 圖1中泳道1～67代表了表1中所列出的1～67號(hào)樣品的電泳檢測結(jié)果，結(jié)果顯示67個(gè)樣品的擴(kuò)增片段均只有大小為218 bp的東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)條帶和大小為166 bp的看家基因(β-actin)條帶，說明所有上述樣品均只感染有東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)。

2.1.2 蜜蜂微孢子蟲(N.apis)檢測結(jié)果 圖2泳道67與68分別代表了采自山東壽光同一蜂場不同蜂群樣品的檢測結(jié)果，67號(hào)樣品檢測出東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)條帶和看家基因(β-actin)條帶。68號(hào)樣品檢測出蜜蜂微孢子蟲(N.apis)條帶看家基因(β-actin)條帶，說明這2份樣品分別感染東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)和蜜蜂微孢子蟲(N.apis)。

表1 樣品信息

Table 1 The messages of the samples collected

省份Province采集地點(diǎn)Samplingsite采集時(shí)間Samplingtime編號(hào)No．黑龍江綏化市純棱縣4．121黑河市嫩江縣5．92雙鴨山市寶清縣5．83海林市6．174吉林盤石市2．15白山市靖寧縣5．126遼寧北票市蒙古營鄉(xiāng)7．287丹東市寬甸11．138陜西商洛市商南縣5．99咸陽市禮泉縣7．310渭南市富平縣12．711河北滄州市河間5．2112承德市5．2213保定市淶源縣王安鎮(zhèn)5．2614北京門頭溝區(qū)4．215房山區(qū)4．816昌平區(qū)4．1817海淀區(qū)香山4．2118通州區(qū)4．2219海淀區(qū)香山4．2320房山區(qū)4．2621房山區(qū)4．2622密云縣太師屯鎮(zhèn)5．223海淀區(qū)香山5．824海淀區(qū)香山5．925門頭溝區(qū)5．2626房山區(qū)5．2727海淀區(qū)香山8．2828門頭溝區(qū)9．2929門頭溝區(qū)-30山西晉城市沁水縣蘇云鄉(xiāng)5．531臨汾市汾西縣5．2432江蘇南通市如東縣3．833徐州市豐縣3．1534佛山市向榮市4．135南通市如皋市6．636揚(yáng)州市儀征岳塘鄉(xiāng)11．1837省份Province采集地點(diǎn)Samplingsite采集時(shí)間Samplingtime編號(hào)No．河南濟(jì)源市3．1238南陽市新野縣4．1739漯河市西平縣4．2940洛陽市宜陽縣趙堡鄉(xiāng)4．2941鄭州市6．1542安徽滁州市來安縣2．2543合肥市巢湖市3．1044滁州市鳳陽縣3．1245滁州市鳳陽縣4．246六安市舒城縣4．847池州市青陽縣5．948黃山市歙縣深渡鎮(zhèn)15．1649黃山市歙縣深渡鎮(zhèn)25．1650文安市10．1451浙江嘉興市永江3．2652湖北天門市2．753黃岡市浠水縣3．354黃岡市紅安縣3．3155孝感市安陸市濮水鎮(zhèn)4．1456武漢市5．157襄樊市南漳縣6．1758湖南常德市4．759四川內(nèi)江市威遠(yuǎn)縣鎮(zhèn)西鎮(zhèn)3．560峨眉山市3．2661廣東深圳市坪山新區(qū)8．1162深圳市龍肖區(qū)9．663山東德州市寧津縣4．764煙臺(tái)市牟平區(qū)王格莊鎮(zhèn)5．965濟(jì)南市5．966濰坊市壽光市111．1467濰坊市壽光市211．1468

表2 引物信息

Table 2 Information of primers

基因Gene引物名Primername序列(5′?3′)Sequence(5′?3′)物種Species產(chǎn)物長度/bpProductlength16SrRNAMITOC?FMITOC?RCGGCGACGATGTGATATGAAAATATTAACCCGGTCATTCTCAAACAAAAAACCG東方蜜蜂微孢子蟲Nosemaceranae21816SrRNAAPIS?FAPIS?RGGGGGCATGTCTTTGACGTACTATGTAGGGGGGCGTTTAAAATGTGAAACAACTATG蜜蜂微孢子蟲Nosemaapis321β?actinβ?actin?Fβ?actin?RGCAAAAAGAAATCACTGCCCTAGGATGGTCCAGACTCGTCGTAT蜜蜂166

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～67.樣品M.DNA molecular weight marker；1-67.Samples圖1 東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)檢測結(jié)果Fig.1 The results of N.ceranae detection

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；67、68.樣品M.DNA molecular weight marker；67，68.Samples圖2 蜜蜂微孢子蟲(N.apis)檢測結(jié)果Fig.2 The results of N.apis detection

2.2 測序結(jié)果

用東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)特異性引物擴(kuò)增出來的218 bp的DNA片段的測序序列與NCBI上GenBank登錄號(hào)分別為EF584422、EF458657、DQ374656、DQ673615和DQ286728的序列進(jìn)行同源性序列比對(duì)，其相似性最高為98%；蜜蜂微孢子蟲(N.apis)特異性引物擴(kuò)增出來的321 bp的DNA片段的測序序列與NCBI上GenBank登錄號(hào)分別為DQ235446、X73894、EU545140、EF458660和EF584423的序列進(jìn)行同源性序列比對(duì)，其相似性最高為83%。

從序列比對(duì)結(jié)果可以看出，兩種微孢子蟲16S rRNA特異序列擴(kuò)增產(chǎn)物與已發(fā)表的東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)和蜜蜂微孢子蟲(N.apis)的16S rRNA序列信息相似度較高，表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)和蜜蜂微孢子蟲(N.apis)的特異序列。

3 討 論

多重PCR對(duì)蜜蜂微孢子蟲的種質(zhì)鑒定中微孢子蟲的檢出率為100%，并且通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析證明了所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為所需要的兩種蜜蜂微孢子蟲條帶，多重PCR方法的高檢出率以及序列分析結(jié)果保證了多重PCR法進(jìn)行微孢子蟲種質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確度和可靠性。

微孢子蟲(nosemaspp.)是中國乃至世界范圍內(nèi)影響蜂群健康發(fā)展的一個(gè)重要病原。隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，自2006年起陸續(xù)在歐洲、美洲及臺(tái)灣等地區(qū)的西方蜜蜂群中發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲[7-9，23，24]，近些年國際范圍內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)許多地區(qū)的西方蜜蜂群(A.mellifera)中東方蜜蜂微孢子蟲(N.ceranae)已逐漸取代蜜蜂孢子蟲(N.apis)成為孢子蟲病的主要病原[6，10-11，13]。本項(xiàng)研究結(jié)果初步明確了東方蜜蜂微孢子蟲在中國西方蜜蜂群中已成為主要的病原種，這一結(jié)果與國際上的研究結(jié)果相同。結(jié)合蜜蜂微孢子蟲病在中國的發(fā)生及流行調(diào)查[25]，認(rèn)為這一結(jié)果有可能是近些年我國蜜蜂微孢子蟲病害流行及危害逐年增加的原因之一。此外，采自山東壽光的同一蜂場的樣品同時(shí)鑒定出了2個(gè)種，這也驗(yàn)證了前人的觀點(diǎn)，即同一個(gè)蜂場可能會(huì)同時(shí)感染2個(gè)種的微孢子蟲[7，21]。

由于項(xiàng)目開展時(shí)間有限，部分省份所采集的樣品相對(duì)缺乏代表性，還有些地區(qū)尚無數(shù)據(jù)，后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)這些地區(qū)繼續(xù)進(jìn)行重點(diǎn)跟蹤調(diào)查，以徹底明確我國蜜蜂微孢子蟲的種系構(gòu)成與分布。

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(編輯 白永平)

Germplasm Distribution ofNosemaspp.inApismelliferain China

ZHANG Jian-yan，DIAO Qing-yun，DAI Ping-li，CHU Yan-na，WU Yan-yan，ZHOU Ting，WANG Qiang*

(KeyLaboratoryofPollinatingInsectBiologyofAgriculture，InstituteofApiculturalResearch，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100093，China)

In order to clarify distribution ofNosemagermplasm in China，68 samples of adult honey bee from 16 provinces of China were collected.All of the samples which with clear signs of population depletion and positive to microsporidian spores using light microscopy were selected for molecular germplasm identification by method of multiplex PCR.The sequenced products of all of the 68 samples were identical to the correspondingNosemaceranaesequence.Only one of samples collected from Shandong was found that had infected byNosemaapis.The results indicated that vast majority species of nosema infectApismelliferain China isNosemaceranae，Nosemaapisis very rare withinApismellifera.

Apismellifera；Nosemaspp.；multiplex PCR；germplasm distribution

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.020

2014-12-24

農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目(2013-S5);中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-2015-IAR)

張建燕(1988-)，女，河南濮陽人，碩士生，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng)研究，E-mail：zhangjianyan2012@126.com

*通信作者：王 強(qiáng)，副研究員，Tel：010-62597285，E-mail：beeprotect@yeah.net

S852.723；S895.39

A

0366-6964(2015)09-1638-06