小型豬復合麻醉頡頏劑對大鼠各腦區p-p38蛋白及c-myc mRNA表達的影響

李 妍，侯金龍，牛棟梁， 姜 勝，時 靜，范宏剛，王洪斌

(東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030)

小型豬復合麻醉頡頏劑對大鼠各腦區p-p38蛋白及c-mycmRNA表達的影響

李 妍#，侯金龍#，牛棟梁， 姜 勝，時 靜，范宏剛，王洪斌*

(東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030)

旨在研究小型豬復合麻醉頡頏劑對大鼠不同腦區p-p38蛋白及c-mycmRNA表達的影響，探討小型豬復合麻醉頡頏劑的催醒機制。將18只大鼠隨機分為C組(對照組)、J組(麻醉頡頏劑組)。J組又分為2個亞組，即J1組(注射小型豬專用復合麻醉頡頏劑5 min)、J2 組(注射小型豬專用復合麻醉頡頏劑1 h)。各組大鼠到達相應的時間點后斷頭處死，分離大腦皮層、小腦、海馬、腦干和丘腦，用Western blot的方法檢測p-p38蛋白的表達量，實時熒光定量PCR方法檢測c-myc基因mRNA的轉錄量。試驗結果顯示大鼠大腦皮層、丘腦和腦干的p-p38蛋白和c-mycmRNA的相對表達量顯著升高，而小腦和海馬的p-p38蛋白和c-mycmRNA的相對表達量顯著降低。綜合試驗結果，小型豬復合麻醉頡頏劑能夠影響p-p38蛋白和c-mycmRNA的表達，這可能是其產生催醒作用的機制之一。

小型豬專用復合麻醉頡頏劑；催醒機制；p-p38蛋白；c-mycmRNA

小型豬復合麻醉頡頏劑是針對小型豬復合麻醉劑(XFM)研制的特異性催醒劑。前期的試驗結果表明該頡頏劑能夠使XFM麻醉狀態下的小型豬平穩蘇醒，無復睡現象，且對機體生理機能影響小，安全性較高[1-3]。然而小型豬復合麻醉頡頏劑產生催醒作用的機制尚不明確。近年來研究發現麻醉劑(如異氟醚、七氟醚和異丙酚等)能夠影響p38MAPK信號轉導通路，由此推測p38MAPK信號轉導通路可能與麻醉作用機制相關[4-8]。前期的研究表明XFM能夠影響p38MAPK信號轉導通路的下游效應物c-mycmRNA的轉錄[9]。麻醉與催醒是兩個相對的藥物作用過程，小型豬復合麻醉頡頏劑產生催醒作用的機制可能與p38MAPK信號轉導通路有關。本試驗主要研究小型豬復合麻醉頡頏劑對大鼠不同腦區p-p38蛋白及c-mycmRNA轉錄的影響，探討小型豬復合麻醉頡頏劑的催醒機制，為進一步深入研究p38MAPK信號轉導通路參與催醒作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小型豬復合麻醉頡頏劑由東北農業大學外科教研室提供，Trizol試劑(北京全式金生物技術有限公司)，反轉錄試劑盒(東洋紡(上海)生物科技有限公司)，熒光定量PCR試劑(寶生物工程(大連)有限公司)，Mouse Anti-beta Actin Monoclonal Antibody (北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號TA-09)、p-p38(Tyr182)(北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號ZS-101759)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術有限公司)，Roche Light Cycler 2.0 熒光定量PCR儀，Sigma高速低溫離心機，Gene Quant 1300紫外可見分光光度計，電泳儀，酶標儀。

1.2 動物分組及樣品采集

將18只大鼠隨機分為C組(對照組)、J組(頡頏劑組)。J組又分為2個亞組，即J1組(注射小型豬復合麻醉頡頏劑5 min)、J2 組(注射小型豬復合麻醉頡頏劑1 h)。每組6只。C組大鼠注射等量的生理鹽水。各組大鼠到達相應的時間點后分別斷頭處死，取出全腦，迅速置于冰面上，分離大腦皮層、海馬、丘腦、腦干和小腦等部位，置于DEPC處理過的凍存管中，液氮速凍后，-80 ℃保存備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 Western blot測定p-p38的含量 采用BCA法測定各腦區總蛋白濃度，吸取樣品，使每孔加入樣品量為25 μg，加入樣品緩沖液補足至20 μL，置于EP管中，沸水煮5 min，置于-80 ℃環境中，備用。以兔抗大鼠p-p38為一抗(1∶400稀釋)，辣根酶標記羊抗兔Ig為二抗(1∶3 000 稀釋)，采用底物增強化學發光ECL法顯色，用X光片壓片或者凝膠成像系統曝光。應用Gel-Pro analyzer 4軟件進行光密度掃描定量，目的蛋白光密度值/內參光密度值，得到各組蛋白條帶相對值進行比較。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測c-mycmRNA轉錄 采用Trizol法提取各腦區組織中總RNA，并用分光光度計測OD260 nm/OD280 nm的比值，通過瓊脂糖凝膠電泳確定產物。根據反轉錄試劑盒說明書步驟，反轉錄總RNA得到第一鏈cDNA。根據GenBank中大鼠的β-actin(NM_031144.3)、c-myc(NM_012603.2)的基因序列，利用Primer 5.0進行引物設計，β-actin上下游引物分別為：5′-AGGGAAA-TCGTGCGTGACAT-3′，5′-CCTCGGGGCATCGGAA-3′，擴增片段為163 bp；c-myc上下游引物分別為：5′-CGACAGTCACGACGATGCC-3′，5′-CT-GCTGTTGCTGGTGATAGA -3′，擴增片段為125 bp；由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根據實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行熒光定量PCR反應。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 各腦區p-p38蛋白的含量

大鼠注射小型豬復合麻醉頡頏劑5min后，大腦皮層和腦干p-p38蛋白的表達量顯著升高，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，海馬p-p38蛋白的表達量顯著降低，與對照組相比差異顯著(P<0.05)；大鼠注射小型豬復合麻醉頡頏劑1h后，大腦皮層p-p38蛋白的表達量恢復到正常水平，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，腦干p-p38蛋白的表達量顯著升高，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，小腦p-p38蛋白的表達量顯著降低，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，丘腦p-p38蛋白的表達量顯著升高，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，海馬p-p38蛋白的表達量恢復到正常水平，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。結果如圖1、表1所示。

圖1 大鼠腦干β-actin和p-p38蛋白免疫印跡結果Fig.1 The β-actin and p-p38 protein expression of brainstem

組別Group大腦皮層Cerebralcortex小腦Cerebellum海馬Hippocampus腦干Brainstem丘腦ThalamusC組 Cgroup0.31±0.030.34±0.040.13±0.031.54±0.081.41±0.08J1組 J1group0.53±0.11B0.25±0.030.06±0.02A2.49±0.04B1.52±0.06J2組 J2group0.35±0.030.18±0.06B0.16±0.033.58±0.31B1.54±0.03A

與對照組相比，A表示差異顯著(P<0.05)，B表示差異極顯著(P<0.01)。下表同

Compared with control group，A represented the difference is significant (P<0.05),B represented the difference is very significant (P<0.01).The same as follows

2.2 RNA純度及完整性的鑒定結果

提取的總RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，可見28S、18S及5S RNA條帶較清晰，說明總RNA無明顯降解，每個樣品測OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.0，說明RNA樣品質量符合實時熒光定量PCR試驗要求。

2.3 實時熒光定量PCR擴增結果

取Real Time PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，產物條帶清晰，且實時熒光定量PCR產物無引物二聚體和雜帶的出現，熔解曲線分析結果均為單峰，β-actinTm值為86.6 ℃，c-mycTm值為84.8 ℃，證明引物特異性良好，無非特異性擴增。倍比稀釋的 cDNA 標準模板后得標準曲線，β-actin標準曲線的相關系數R2=0.998 1，擴增效率為1.016 3；c-myc標準曲線的相關系數R2=0.992 3，擴增效率為1.039。結果如圖2所示。

2.4 中樞神經系統c-mycmRNA轉錄變化

大鼠注射小型豬復合麻醉頡頏劑5 min(J1組)，大腦皮層c-mycmRNA的轉錄量顯著升高，與對照組相比差異顯著(P<0.05)；小腦c-mycmRNA的轉錄量顯著降低，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；海馬c-mycmRNA的轉錄量顯著降低，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；腦干和丘腦c-mycmRNA的轉錄量顯著升高，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。大鼠注射小型豬復合麻醉頡頏劑1 h后(J2組)，大腦皮層c-mycmRNA恢復正常水平，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；小腦c-mycmRNA的轉錄量1 h后(J2組)有所回升，但與對照組相比，差異顯著(P<0.05)；海馬c-mycmRNA的轉錄量1 h后(J2組)有所升高，但未升高到正常水平，與對照組相比差異顯著(P<0.05)；腦干和丘腦c-mycmRNA的表達量1 h后(J2組)有所下降，但未下降到正常水平，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。(表2)

3 討 論

p38蛋白激酶是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的重要成員，可被外界環境因素如化學物質、熱/滲透性休克、紫外線、氧化失衡，或者某些生理性原因如促有絲分裂/促發育信號、神經遞質、炎性因子等刺激物激活，繼而介導凋亡等細胞反應[10]。p38MAPK主要在MKK的作用下成為有活性的磷酸化p38[11-12]，然后進一步將信號向下游傳遞。c-myc為p38下游信號分子之一[13]，是調控細胞增殖的重要基因，與細胞的生長、分化有關，對凋亡也起重要作用[14]。

M.DL2000 DNA 相對分子質量標準；1.β-actin PCR產物凝膠電泳結果；2.c-myc PCR產物凝膠電泳結果M.DL2000 DNA marker；1.PCR product of β-actin；2.PCR product of c-myc圖2 β-actin、c-myc PCR產物電泳結果及擴增曲線Fig 2 The product of β-actin，c-myc PCR and the amplification curve

組別Group大腦皮層Cerebralcortex小腦Cerebellum海馬Hippocampus腦干Brainstem丘腦ThalamusC組 Cgroup2.88±0.091.51±0.051.02±0.101.23±0.031.75±0.05J1組 J1group3.13±0.12A1.15±0.06B0.73±0.11B3.79±0.11B2.67±0.08BJ2組 J2group2.76±0.081.40±0.06A0.94±0.07A3.19±0.17B2.45±0.06B

近年來研究發現p38MAPK信號轉導通路在神經系統中發揮重要的作用，尤其是在學習記憶過程中。手術、麻醉等因素能夠引起術后認知功能障礙(POCD)，研究報道p38MAPK通路可被應激刺激、炎性因子等激活，全身麻醉藥(異氟烷等)誘導炎癥因子的表達，并通過炎癥因子進一步激活p38MAPK通路，從而誘發新生大鼠的學習與記憶功能損害[4]。全身麻醉藥與p38MAPK信號通路密切相關，研究發現吸入麻醉劑——異氟醚、七氟醚能夠影響大鼠中樞神經系統中p38的表達[5-6]；此外也有靜脈麻醉劑(異丙酚)對大鼠腦星形膠質細胞中p38表達的影響[7-8]的報道。綜上，可以看出p38MAPK信號轉導通路與麻醉機制存在一定的聯系。

通過預試驗，大鼠在注射XFM翻正反射消失后，注射小型豬復合麻醉頡頏劑，大鼠翻正反射恢復的時間大約為5.2 min，說明小型豬復合麻醉頡頏劑在這個時間范圍內發揮了催醒作用，因此設定了5 min為頡頏劑組的一個采樣時間點，為了觀察小型豬復合麻醉頡頏劑的催醒之后的作用，設定了1 h為頡頏劑組的另一個采樣時間點。

在本試驗中，大鼠根據不同組別進行處理后，分別注射小型豬專用復合麻醉頡頏劑在不同的時間點采取大腦皮層、小腦、海馬、腦干和丘腦，應用Western blot方法檢測p-p38蛋白的相對表達量，試驗結果顯示大腦皮層、丘腦和腦干的p-p38蛋白的相對表達量顯著升高，而小腦和海馬的p-p38蛋白的相對表達量顯著降低；結果提示小型豬復合麻醉頡頏劑對大腦皮層、丘腦和腦干的p-p38蛋白的相對表達量有促進作用，對小腦和海馬的p-p38蛋白的相對表達量有抑制作用。綜合以上分析可知小型豬復合麻醉頡頏劑影響腦內p-p38蛋白的表達。有研究表明，靜脈麻醉劑異丙酚能夠降低氨處理大鼠腦皮質星形膠質細胞磷酸化p38蛋白的含量，抑制p38MAPK信號通路的激活[7]，這與本試驗中大腦皮層p-p38蛋白的含量升高結果相反。吸入麻醉劑異氟醚能夠提高海馬腦區p38蛋白的含量激活p38MAPK信號通路，從而誘發大鼠認知功能障礙[6]，這與本試驗中海馬腦區p-p38蛋白的含量降低結果相反。實時熒光定量PCR結果顯示大腦皮層、丘腦和腦干的c-mycmRNA的相對轉錄量顯著升高，而小腦和海馬的c-mycmRNA的相對轉錄量顯著降低。提示小型豬專用復合麻醉頡頏劑對大腦皮層、丘腦和腦干的c-mycmRNA的相對轉錄量有促進作用，對小腦和海馬的c-mycmRNA的相對轉錄量有抑制作用。大鼠各腦區c-mycmRNA的變化趨勢與p-p38蛋白的變化趨勢基本一致。以往研究表明，p38MARK可以通過增強c-myc轉錄引起細胞凋亡[13-14]。本試驗結果顯示小型豬復合麻醉頡頏劑對大鼠海馬和小腦區p-p38蛋白表達和c-mycmRNA轉錄均有抑制作用，所以推測小型豬復合麻醉頡頏劑可能通過降低大鼠海馬和小腦區p-p38蛋白表達和c-mycmRNA轉錄從而降低對中樞神經的抑制作用，達到催醒效果。這可能是小型豬復合麻醉頡頏劑產生催醒作用的機制之一。

4 結 論

小型豬復合麻醉頡頏劑能夠降低大鼠海馬和小腦區p-p38蛋白表達和c-mycmRNA轉錄，這可能是小型豬復合麻醉頡頏劑催醒XFM麻醉的重要機制之一。

[1] 李小波，尹柏雙，李志強，等．小型豬特異性麻醉頡頏劑對XFM麻醉下大鼠海馬c-jun基因mRNA轉錄的影響[J]．畜牧獸醫學報，2012，43(10)：1664-1668． LI X B，YIN B S，LI Z Q，et al.Effects of the specificity antagonist for miniature pigs combined anaesthetic on the transcription ofc-jungene mRNA in the hippocampus of rats anesthetized with XFM[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2012，43(10)：1664-1668.(in Chinese)

[2] 盧德章．小型豬特異性麻醉頡頏劑的研制及其催醒機理的研究[D]．哈爾濱：東北農業大學，2011：4-120． LU D Z.Development of the specificity antagonist for miniature pigs’ combined anaesthetic and study on its mechanisms of antagonism[D].Harbin：Northeast Agricultural University，2011：4-120.(in Chinese)

[3] 馬 昆．小型豬特異性麻醉頡頏劑催醒效果綜合監測[D]．哈爾濱：東北農業大學，2011：83-84． MA K.Comprehensive monitoring on specificity antagonist for miniature pigs’ combined anaesthetic [D].Harbin：Northeast Agricultural University，2011：83-84.(in Chinese)

[4] LYCNCH M A．Long-term potentiation and memory[J]．PhysiolRev，2004，84(1)：87-136．

[5] 李玉娟，柳垂亮，張 靜，等．異氟醚和七氟醚對新生大鼠皮質凋亡以及JNK和p38表達的不同影響[J]．中國病理生理雜志，2011，27(1)：72-76． LI Y J，LIU C L，ZHANG J，et al.Effects of isoflurane and sevoflurane on apoptosis of cortical neuron in neonatal rats and the role of MAPKs pathway[J].ChineseJournalofPathophysiology，2011，27(1)：72-76.(in Chinese)

[6] 王 強，由振東，石雪銀，等．異氟醚吸入對新生大鼠認知功能的影響及p38MAPK抑制劑的干預作用[J]．山東醫藥，2011，51(19)：21-23． WANG Q，YOU Z D，SHI X Y，et al.Effects of isoflurane on the cognitive function of neonatal rats and intervention roles of p38MAPK inhibitor[J].ShandongMedicalJournal，2011，51(19):21-23.(in Chinese)

[7] 潘彩飛，祝勝美．異丙酚通過抑制p38激活下調氨處理的大鼠腦星形膠質細胞AQP4的表達并減輕細胞水腫[J]．中國病理生理雜志，2010，26(1)：96-100． PAN C F，ZHU S M.Propofol attenuates aquaporin-4 over-expression through p38 pathway on ammonia-induced neocortical astrocyte in rats[J].ChineseJournalofPathophysiology，2010，26(1):96-100.(in Chinese)

[8] 曹慧靈，但 伶，鄧必高．異丙酚抑制脂多糖致大鼠腦損傷時p38MAPK的活化[J]．中國病理生理雜志，2011，27(8)：1639-1642． CAO H L，DAN L，DENG B G.Propofol inhibits activation of p38MAPK in rat brain tissues with LPS-induced brain injury[J].ChineseJournalofPathophysiology，2011，27(8)：1639-1642.(in Chinese)

[9] 侯金龍，姜 勝，李 妍，等．小型豬專用復合麻醉劑對大鼠中樞神經系統c-myc基因和iNOS基因mRNA轉錄的影響[J]．畜牧獸醫學報，2014，45(1)：160-164. HOU J L，JIANG S，LI Y，et al.Transcription ofc-mycmRNA andiNOSmRNA in central nervous system in rats anesthetized with the combined anaesthetic for miniature pigs[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2014，45(1)：160-164.(in Chinese)

[10] ZHU X W，ROTTKAMP C A，HARTZLER A，et al．Activation of MKK6，an upstream activator of p38，in Alzheimer’s disease[J]．JNeurochem，2001，79(2)：311-318．

[11] MARTIN-BLANCO E．p38MAPK signalling cascades：ancient roles and new functions[J]．Bioessays，2000，22(7)：637-645．

[12] ONO K，HAN J．The p38 signal transduction pathway：activation and function[J]．CellSingnal，2000，12(1)：1-13．

[13] 張 沖．P38MAPK和JNK信號通路在阿爾茨海默病、帕金森病患者外周血淋巴細胞中的表達及意義[D]．石家莊：河北醫科大學，2012：21-24． ZHANG C.Expression and significiance of P38MAPK and JNK pathways in lymphocytes of Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease patients[D].Shijiazhuang：Hebei Medical University，2012：21-24.(in Chinese)[14] 胡建鵬，王 健，郜 巒，等．局灶性腦缺血再灌注時神經元、膠質細胞形態變化與TNF-α、c-Myc表達相關的實驗研究[J]．中國病理生理雜志，2004，20(7)：1251-1255． HU J P，WANG J，GAO L，et al.Relationship between morphologic changes in neuron or neuroglial cells and expression of TNF-α and c-Myc in cortex after focal cerebral ischemia/reperfusion in MCAO rats[J].ChineseJournalofPathophysiology，2004，20 (7)：1251-1255.(in Chinese)

[15] 張頻捷，朱立新，耿小平．p38 MAPK信號傳導通路及其抑制劑的研究現狀[J]．安徽醫藥，2010，14 (5)：596-598． ZHANG P J，ZHU L X，GENG X P.p38 mitogen activated protein kinase pathway and its inhibitor[J].AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal，2010，14(5)：596-598.(in Chinese)

[16] AMBROSINO C， NEBREDA A R．Cell cycle regulation by p38 MAP kinase[J]．BiolCell，2001，93(1-2)：47-51．

(編輯 白永平)

Effect of the Antagonist for the Combined Anaesthetic for Miniature Pigs on p-p38 Protein andc-mycGene in Brain Regions of Rats

LI Yan#，HOU Jin-long#，NIU Dong-liang，JIANG Sheng， SHI Jing，FAN Hong-gang，WANG Hong-bin*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

In order to investigate the effects of antagonist for the Combined Anaesthetic for Miniature Pigs (XFM) on p-p38 protein andc-mycgene in different encephalic region of rats，and discuss the mechanism of XFM antagonist.Eighteen Wistar rats were divided randomly into C (Control group) and J (Antagonist group) group.J group consisted of two subgroups，J1(5 min after rats received the XFM antagonist intraperitoneally) and J2 (1 h after rats received the XFM antagonist intraperitoneally).The brain tissues were collected at each time point.The expression of p-p38 in different brains regions were detected by Western blot.The transcription ofc-mycmRNA in different brains regions were detected by real time PCR.The results showed that the expression of p-p38 andc-mycmRNA in cerebral cortex，thalamus and brain stem increased significantly；the expression of p-p38 andc-mycmRNA in cerebellum and hippocampus decreased significantly.These results indicated that p-p38 protein andc-mycgene were affected by the XFM antagonist，this may be one of the antagonism mechanisms.

antagonist for XFM；antagonism mechanism；p-p38 protein；c-mycmRNA

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.020

2014-04-10

國家自然科學基金項目(31272617；31001092)

李 妍(1988-)，女，河南安陽人，碩士，主要從事麻醉與鎮痛研究，E-mail：liyan8835@yeah.net；侯金龍(1986-)，男，助理實驗師，主要從事動物麻醉研究，E-mail：2680310282@qq.com。二人對本文同等貢獻，共為第一作者

*通信作者：王洪斌，教授，博士生導師，E-mail：neau1940@yahoo.com.cn

S859.791

A

0366-6964(2015)02-0317-06