豬冷凍精子的細胞凋亡及凋亡途徑初步研究

王 昕，戴建軍，吳彩鳳，張樹山，吳鋆龍，張德福

(1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306； 2.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106； 3.上海農業遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106)

豬冷凍精子的細胞凋亡及凋亡途徑初步研究

王 昕1,2,3，戴建軍1,2*，吳彩鳳1,2，張樹山1,2，吳鋆龍1,2,3，張德福1,2*

(1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306； 2.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106； 3.上海農業遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106)

旨在研究低溫冷凍解凍對精子細胞凋亡的影響，并探討凋亡發生的可能相關途徑。采用流式細胞儀檢測解凍后精子內的ROS水平和TUNEL染色后的細胞凋亡情況，使用酶標儀檢測精子內ATP含量，利用相對熒光定量PCR技術檢測不同凋亡途徑中相關基因的表達量變化。結果表明：冷凍后精子活力、頂體和質膜完整率顯著下降(P<0.05)；冷凍精子TUNEL染色后的凋亡率(80.4%)與新鮮組(9.7%)相比顯著升高(P<0.05)；冷凍組精子內ROS綠色熒光比率(58.2%)亦顯著高于新鮮組(P<0.05)；與新鮮組0.926 μmol·L-1的ATP濃度相比，冷凍組精子的ATP濃度(0.247 μmol·L-1)則顯著下降(P<0.05)；qRT-PCR檢測結果顯示，冷凍組中TNF-α、Fas、Caspase家族、P53和Bax基因相對表達量升高，其中Fas、P53、TNF-α、Caspase-8和Caspase-9等相對表達量顯著升高(P<0.05)；BCL-2、BIRC-5、MnSOD、CuZnSOD和SURVIVN基因相對表達量降低，其中BIRC-5、MnSOD、SURVIVN顯著降低(P<0.05)。結果表明：低溫冷凍解凍會使豬精子細胞發生嚴重的凋亡，死亡受體外源性凋亡途徑和線粒體內源性凋亡途徑均可能介導了冷凍后精子的凋亡。

豬；精子冷凍；細胞凋亡；凋亡途徑

精子冷凍技術是現代比較常用的輔助生殖技術，可長期有效保存有價值的基因資源，提高種公畜的利用效率和地區間交流。經過近半個世紀的研究，該技術的發展水平已有很大提高，但公豬由于精子結構的特殊性，對溫度變化特別敏感,導致其抗低溫能力弱于其他動物[1]。研究也表明，精漿中的部分成分會導致豬冷凍精子活力降低甚至死亡[2]，再加上豬每次射精和輸精量均較大，現有的豬精液冷凍技術仍不能完全滿足實際生產的需求，因此對冷凍導致的豬精子損傷機理研究顯得尤為迫切。

線粒體內源性凋亡途徑和死亡受體外源性凋亡途徑是哺乳動物細胞凋亡的兩個主要途徑。所有的凋亡途徑都是半胱天冬酶和天冬氨酸參與的復雜過程[3-5]。線粒體內源途徑主要通過活化Caspase-9，激活Caspase-3而產生Caspase的一系列級聯反應；死亡受體外源途徑，影響因子主要包括Fas和TNF等，產生有活性的Caspase-8激活下游Caspase級聯效應。兩個途徑的共同參與凋亡信號的傳導，引起細胞嚴重凋亡。豬精子冷凍后細胞的凋亡現象已有所報道，但冷凍介導的豬精子細胞凋亡途徑研究則相對較少，本文通過TUNEL法檢測細胞凋亡，細胞內活性氧(Reactive oxygen species，ROS)與ATP水平檢測衡量線粒體功能，相對熒光定量PCR技術檢測不同凋亡途徑中凋亡相關基因的表達量，進而分析低溫冷凍解凍豬精子的細胞凋亡現象，確定介導豬精子細胞凋亡的主要途徑，為日后進一步提高冷凍效率提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 精液采集

精液采集于上海白豬(農系)原種場。經HARMONY稀釋液等溫1∶1稀釋之后，17 ℃保存，2 h內運回實驗室。3層濾紙過濾，檢測活力，活力≥0.8的精液用于低溫冷凍。試驗分別采用3頭上海白公豬進行重復。

1.2 冷凍和解凍液配制

冷凍基礎液(TCG)：葡萄糖1.1 g，檸檬酸1.48 g，Tris 2.42 g，1 mL雙抗，pH7.4，雙蒸水定容至100 mL，0.22 μm濾器過濾后，置于4 ℃保存。冷凍I液：體積分數80%的TCG液與20%的卵黃液混合均勻。冷凍II液：體積分數91%的冷凍I液與9%的甘油混合。解凍液(BTS)：葡萄糖3.7 g，二水檸檬酸鈉0.6 g，碳酸氫鈉0.125 g，EDTA 0.125 g，氯化鉀0.075 g，1 mL雙抗，雙蒸水定容至100 mL。

1.3 細管冷凍精液的制作與解凍

用50 mL離心管分裝好的精液，置于17 ℃恒溫冰箱平衡2 h，期間多次上下顛倒混勻，在室溫下800 g離心10 min后，棄上清，取沉淀與冷凍I液1∶1稀釋，置于4 ℃平衡2 h；取出后加入與冷凍I液同體積的冷凍II液，置于4 ℃平衡1 h后，分裝于0.25 mL的細管中，封口機封口，用液氮熏蒸法(距液氮面5 cm處熏蒸12 min)處理后，投入液氮保存。解凍時，將細管放入62 ℃水中4 s。待其溶解后取出，擦除表面水珠，并剪開兩端，1∶1加入事先準備好的等體積BTS解凍液中，輕輕混勻后，置于17 ℃冰箱中備用。

1.4 精子質量檢測

精子活力檢測：分別取10 μL新鮮精液和凍融精液于37 ℃預熱的載玻片上，從液滴一側蓋37 ℃預熱的蓋玻片。400×顯微鏡下鏡檢，計算精子活力。頂體完整性檢測：考馬斯亮藍染色后，400×相差顯微鏡下隨機觀察200個精子，計算頂體完整率。質膜完整性檢測：取50 μL精液于1 mL 37 ℃的低滲液中混勻，37 ℃水浴30 min，取10 μL液體于載玻片上，400×相差顯微鏡下鏡檢，計算質膜完整率。

1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡

一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所。每200 μL精液加入2 mL 4%的多聚甲醛，置于搖床固定1 h后取出，PBS清洗，每組各加入2 mL 0.1%Triton重懸，冰浴2 min，再用PBS清洗2遍后，加入50 μL TUNEL檢測液(TdT酶8 μL，熒光標記液48 μL混勻)，37 ℃避光孵育1 h后，洗滌殘余TUNEL檢測液，1 mL PBS懸浮精子，借助熒光顯微鏡初步觀察綠色熒光強度，并利用流式細胞儀進行凋亡率統計(激發波長設置為450～500 nm，發射波長為515～565 nm)。

1.6 流式細胞儀檢測細胞內ROS水平

活性氧ROS試劑盒購于碧云天生物技術研究所。將DCFH-DA與PBS按1∶1 000稀釋成為工作液，分別加500 μL工作液與500 μL精子細胞混合后，避光置于37 ℃培養箱中，孵育20 min(每3～5 min顛倒混勻1次)。再用PBS洗滌3次，然后用流式細胞儀檢測(激發波長為488 nm，發射波長為525 nm)[6-7]。

1.7 細胞內ATP濃度檢測

童話大王鄭淵潔說：“寫童話，我不如孩子！”童話大王為什么這么說呢？大概是因為隨著年齡的增長，人的認識越來越理性。人越來越成熟，而童真童趣卻離我們越來越遠。也許，在你三歲的時候，你會說出“風把嗓子哭啞了”這樣的句子，而現在卻只能說出“狂風怒吼”這樣的成語……想要找回自己的童真童趣，一定有很多辦法。今天老師要介紹的方法就是：在比你更小的小小孩身上去尋找自己的童年。你有三四歲的小弟弟小妹妹嗎？請觀察他們，記錄他們的行為、他們的語言……持續觀察一些日子，你一定會有所收獲的。

ATP檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所。取新鮮組和冷凍組200 μL精子樣品(調整精子密度至1.5×105mL-1)，各加入等體積裂解液，充分作用后，離心取上清液100 μL加入等體積ATP檢測工作液，室溫放置2 s后，立即用luminometer測定RLU值。標準曲線繪制時設定1.0、0.5和0.1 μmol·L-13個濃度梯度。

1.8 總RNA提取和反轉錄

取1 mL精液，用酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法提取(RNAiso Plus，購于TaKaRa公司)，RNase free ddH2O溶解RNA，測OD值為1.8～2.0可用。用FastQuant RT Kit(With gDNA)試劑盒進行反轉錄(天根生化科技有限公司)，樣品存放于-80 ℃保存待用。

1.9 qRT-PCR

參考NCBI獲得與豬精子凋亡有關基因的cDNA序列并設計引物，GAPDH為內參基因。相關引物信息見表1，用SYBR?GreenI嵌合熒光法(SYBR Premix Ex TaqTMII試劑購于TaKaRa公司)進行Real Time PCR。反應體系：SYBR?Premix Ex Taq II(2×) 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX II 0.4 μL，cDNA模板2 μL，加ddH2O至20 μL體系。反應條件：預變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s，退火34 s(Tm均為55 ℃)，72 ℃延伸30 s，35個循環，退火并收集熒光，每個樣品重復3次。

表1 qRT-PCR所需基因引物信息

Table 1 Primer used for qRT-PCR

引物名稱Primername引物序列(5′→3′)Primersequence上游引物Forwardprimer下游引物ReverseprimerGAPDHCACGATGGTGAAGGTCGGAGTTGACTGTGCCGTGGAACTTTNF?αATTCAGGGATGTGTGGCCTGCCAGATGTCCCAGGTTGCATBIRC?5ACCACCGCATCTCCACATTTTGGGACAGTGGATGAAACCGP53GAACAGCTTTGAGGTGCGTGGCCATCCAGTGGCTTCTTCTBaxGCCGAAATGTTTGCTGACGGCGAAGGAAGTCCAGCGTCCAFasCGTGAGGGTCAATTCTGCTGTCTTGTCTGTGTAATCCTCCCCCCaspase?3CCGAGGCACAGAATTGGACTTTTCAGCGCTGCACAAAGTGCaspase?8AGGCCCTGCTGAAGAAAATCTCCTGTTCTCCCAGACAGTCCCaspase?9AACTTCTGCCATGAGTCGGGCCAAAGCCTGGACCATTTGCBCL?2GGCAACCCATCCTGGCACCTAACTCATCGCCCGCCTCCCTSURVIVNACCACCGCATCTCCACATTTTGGGACAGTGGATGAAACCGCuZnSODGTGCAGGGCACCATCTACTTTCTTGATCCTTTGGCCCACCMnSODCCCAAAGGGGAATTGCTGGAAACAAGCGGCAATCTGCAAG

1.10 統計分析

數據采用SPSS17.0進行多重分析，以P<0.05為差異顯著。qRT-PCR以GAPDH為內參基因，新鮮組和冷凍組各基因的相對表達量采用2-△△Ct法計算。

2 結 果

2.1 冷凍對精子活力、頂體和質膜完整率的影響

如表2所示，冷凍組與新鮮組精子細胞相比，精子活力(40.12vs93.20)、頂體完整率(47.00vs83.56)和質膜完整率(38.85vs82.41)均顯著降低(P<0.05)。

如圖1所示，綠色熒光顯示精子細胞凋亡。新鮮組(圖1A)TUNEL陽性精子細胞少，綠色熒光信號弱，冷凍組(圖1 B)TUNEL陽性精子細胞多，綠色熒光信號強。流式細胞儀檢測結果(圖2)數據如表3所示，新鮮組精子細胞TUNEL陽性率為9.7%，冷凍組TUNEL陽性率為80.4%，冷凍解凍后精子細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。

表2 冷凍對精子活力、頂體完整率和質膜完整率的影響

Table 2 Effect of cryopreservation on sperm motility，normal acrosome rate and plasma membrane integrity rate %

同列上標不同小寫英文字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

Means in the same volumn with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).The same as below

表3 流式細胞儀檢測TUNEL陽性凋亡比例

Table 3 Percentage of TUNEL positive apoptosis spermatozoa by FCM analyses(%±SEM)

組別GroupsTUNEL陽性TUNELpositiveTUNEL陰性TUNELnegative新鮮組Freshgroup9．7±1．5a90．3±1．5a冷凍組Freezinggroup80．4±6．1b19．8±6．1b

2.3 冷凍對精子內ROS水平的影響

如圖3所示，設置新鮮組為陰性對照(圖3左曲線)，比較冷凍組(圖3右曲線)中ROS綠色熒光陽性比率。結果顯示與陰性對照相比，冷凍組ROS綠色熒光比率(58.2%±1.27%)顯著升高(P<0.05)。

2.4 冷凍對精子內ATP濃度的影響

一定范圍內的熒光產生與細胞內ATP濃度成正比，可得出細胞內ATP濃度標準曲線(圖4)。測得樣品的RLU值后根據標準曲線分別計算新鮮組和冷凍組細胞的ATP濃度，冷凍組ATP濃度(0.247±0.04 μmol·L-1)與新鮮組(0.926±0.19 μmol·L-1)相比顯著降低(P<0.05)。

2.5 豬精子細胞與凋亡有關基因mRNA實時定量PCR結果

采用GAPDH基因作為管家基因，新鮮組各基因mRNA的相對表達量均以1表示，比較冷凍組各凋亡相關基因mRNA表達變化。qRT-PCR結果表明(圖5)，與新鮮組相比，冷凍組BCL-2，CuZnSOD基因的相對表達量降低，MnSOD、SURVIVN、BIRC-5基因相對表達量顯著降低(P<0.05)；冷凍后精子Bax、Caspase-3等基因相對表達量升高，TNF-α、P53、Fas、Caspase-8、Caspase-9等基因相對表達量顯著升高(P<0.05)。

A.新鮮組;B.冷凍組.綠色熒光表示TUNEL陽性，不發光表示TUNEL陰性A.Fresh group;B.Freezing group.Green fluorescent show TUNEL positive and no fluorescent show TUNEL negative圖1 熒光顯微鏡下精子的TUNEL染色情況 400× Fig.1 TUNEL staining of spermatozoa under fluorescent microscope 400×

A、B.新鮮組檢測圖;C、D.冷凍組檢測圖；M1.TUNEL陰性;M2.TUNEL陽性A,B.Fresh；C,D.Freezing.M1.TUNEL negative；M2.TUNEL positive圖2 流式細胞儀檢測精子凋亡率Fig.2 Dot-plots and histogram analysis of spermatozoa apoptosis rate

圖3 流式細胞儀檢測凍融精子細胞內ROS水平Fig.3 Histogram analysis of ROS levels in post-thawed spermatozoa by FCM

3 討 論

本試驗從ATP和ROS水平研究凍融精子的線粒體狀態，闡述其與精子凋亡之間的聯系。S.Chatterjee等[8]和C.Ortege-ferrusola等[9]在對牛和馬的精子超低溫冷凍后發現，冷凍可以使精子ATP濃度下降，精子發生“似凋亡”現象。U.Paash等[10]對人類精子冷凍后發現，凍精細胞內的ATP含量亦顯著降低。本試驗中豬精子冷凍解凍后的ATP濃度亦表現為顯著下降，表明線粒體的功能在凍后受到顯著影響。X.Wang等[11]研究表明，氧化應激是造成人類精子發生凋亡的一個重要原因。L.K.Thomson等[12]在人類精子冷凍研究中發現，冷凍可使精子發生明顯的氧化應激反應，提升細胞內ROS水平。本研究中，豬精子冷凍后其DCF綠色熒光比率顯著增加，說明在冷凍解凍過程中精子細胞內產生大量的ROS參與了調控精子細胞的凋亡過程。

G.Martin等[13]和A.M.Brum等[14]在牛和馬精子冷凍過程中發現，凋亡現象主要表現有精子活力喪失，磷脂酰絲氨酸外翻(PS)，Caspase活化，DNA氧化損傷等。本研究豬冷凍組精子細胞經TUNEL染色后，熒光陽性比率顯著增加。表明精子細胞發生DNA斷裂，DNA碎片增多，凍融精子細胞凋亡嚴重，與牛[13]和馬[14]方面的研究結果相一致。

*.P<0.05圖4 冷凍對豬精子ATP濃度的影響Fig.4 Effect of cryopreservation on ATP concentration of post-thawed spermatozoa

*.P<0.05.1.Fas；2.P53;3.TNF-α;4.Bax;5.BCL-2;6.BIRC-5;7.MnSOD;8.CuZnSOD;9.SURVIVN;10.Caspase-3;11.Caspase-8;12.Caspase-9圖5 新鮮組和冷凍組精子細胞各基因的mRNA表達結果Fig.5 The expression of mRNA in fresh and freezing groups

細胞凋亡是由基因控制的細胞主動死亡的過程，Fas、Bax、P53基因有促進凋亡的作用，BIRC-5、BCL-2基因有抑制凋亡的作用，Caspase酶原本身需通過活化導致細胞凋亡。本研究TNF-α、Fas、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、P53和Bax基因相對表達量升高，BIRC-5、BCL-2基因相對表達量降低，其中TNF-α、Fas、P53、Caspase-8和Caspase-9顯著升高，結果與Y.J.Jeong等[15]的研究結果一致，說明在精子細胞凋亡過程中促凋亡因子的作用增強，抑制凋亡發生因子的作用能力減弱，最終導致凋亡現象的發生，與J.F.Kerr等在其他哺乳動物上的研究結果基本相似[16]。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)能有效清除胞內ROS，抑制精子凋亡現象發生，提升精子活力。與合成SOD直接關聯的MnSOD，CuZnSOD和SURVIVN等抗凋亡抗氧化基因廣泛存在于真核細胞線粒體內膜中，本試驗中冷凍解凍精子內MnSOD、CuZnSOD和SURVIVN等抗凋亡基因相對表達量降低，該結果與前人研究[17-18]一致，說明冷凍過程中線粒體的功能受到明顯抑制，SOD相關基因表達下降，無法有效清除細胞內產生的大量ROS，導致細胞內ROS水平顯著升高，ATP濃度顯著下降，TUNEL陽性細胞比率顯著增加，精子嚴重凋亡。

凋亡信號通路表明，Fas、TNF和相關Caspase(例如Caspase-8和Caspase-10)參與死亡受體外源性途徑[19]，本研究表明，冷凍后Fas、TNF-α和Caspase-8顯著上調說明冷凍造成的精子細胞凋亡有外源性途徑的參與。在線粒體介導的內源性途徑中[20]，細胞應激反應或凋亡信號能引起細胞色素C釋放，細胞色素C作為凋亡誘導因子，能經Caspase-9酶原活化并導致下游酶活性放大(例如Caspase-3和8)而參與線粒體內源性凋亡。另外BCL-2可以通過抑制線粒體通透性轉換孔開放而抑制凋亡，Bax則可以促進線粒體通透性轉換孔開放而促進凋亡[21]。本研究顯示精子冷凍后線粒體內源途徑相關基因Caspase-9和Caspase-3表達上調，參與調節Caspase-9蛋白表達的抑制凋亡因子BCL-2下調，促凋亡因子Bax上調，均提示線粒體介導的內源性凋亡途徑也參與了凍后精子細胞的凋亡。C.J.Zeng等[22]研究也與本試結果相似，表明Fas和BCL-2/Bax等基因的表達與精子凋亡有非常明顯的相關性，主要是與Caspase-6/9酶被激活有關。綜上表明，低溫冷凍解凍過程中，線粒體內源性途徑和死亡受體外源性途徑均介導豬精子細胞發生凋亡，兩條通路聯系起來擴大了凋亡信號的傳導。本試驗通過研究豬精子細胞經過冷凍解凍后發生的凋亡現象和與凋亡途徑有關的基因表達，證明低溫是影響豬凍融精子活力下降的重要因素，初步確定介導凍融精子細胞凋亡的有效途徑，為日后精子抗凍保護劑中凋亡抑制劑和抗氧化劑等的添加提供了理論參考。

[1] JOHNSON L A,WEITZE K F,FISER P，et al.Storage of boar semen[J].AnimReprodSci,2000，62(1-3)：143-172.

[2] OKAZAKI T,SHIMADA M.New strategies of boar sperm cryopreservation：development of novel freezing and thawing methods with a focus on the roles of seminal plasma[J].AnimSciJ，2012，83(9):623-629.

[3] FIORE C,TREZEGUET V,LE S A,et al.The mitochondrial ADP/ATP carrier：structural，physiological and pathological aspects[J].Biochemie，1998，80(2)：137-150.

[4] KINNALLY K W,ANTONSSON B.A tale of two mitochondrial channels，MAC and PTP，in apoptosis[J].Apoptosis,2007,12：857-868.

[5] RASOLA A,BERNARDI P.The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and disease pathogenesis[J].Apoptosis,2007,12(5)：815-833.

[6] CROW J P.Dichlorodihydrofluorescein and dihydrorhodamine 123 are sensitive indicators of peroxynitriteinvitro: implications for intracellular measurement of reactive nitrogen and oxygen species[J].NitricOxide：BiolChem,1997,1(2)：145-157.

[7] WANG H,JOSEPH J A.Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate reader[J].FreeRadicBiolMed，1999，27(5-6)：612-616.

[8] CHATTERJEE S,GAGNON C.Production of reactive oxygen species by spermatozoa undergoing cooling，freezing，and thawing[J].MolReprodDev，2001,59：451-458.

[9] ORTEGA-FERRUSOLA C,SOTILLO-GALAN Y,VARELA-FERNANDEZ E，et al.Detection of “Apoptosis-Like” changes during the cryopreservation process in equine sperm[J].JAndrol, 2008，29(2)：213-221.

[10] PAASH U,SHARMA R K,GUPTA A K,et al.Cryopreservation and thawing is associated with varying extent of activation of apoptotic machinery in subsets of ejaculated human spermatozoa[J].BiolReprod，2004，71：1828-1837.

[11] WANG X,SHARMA R K,SIKKA S C,et al.Oxidative stress is associated with increased apoptosis leading to spermatozoa DNA damage in patients with male factor infertility[J].FertilSteril, 2003，80(3)：531-535.[12] THOMSON L K,FLEMING S D,AITKEN R J,et al.Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis[J].HumReprod，2009,24(9)：2061-2070.

[13] MARTIN G,SABIDO O,DURAND P,et al.Cryopreservation induces an apoptosis-like mechanism in bull sperm[J].BiolReprod，2004,71：28-37.

[14] BRUM A M,SABEUR K,BALL B A.Apoptotic-like changes in equine spermatozoa separated by density-gradient centrifugation or after cryopreservation[J].Theriogenology,2008,69(9)：1041-1055

[15] JEONG Y J，KIM M K,SONG H J,et al.Effect of alpha-tocopherol supplementation during boar semen cryopreservation on sperm characteristics and expression of apoptosis related genes[J].Cryobiol,2009,58(2):181-189.

[16] KERR J F,WYLLIE A H，CURRIE A R.Apoptosis：a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J].BrJCancer,1972,26(2)：239-257.

[17] 王明臣,郭茂鋒,趙國強，等.前列腺癌及良性前列腺癌增生組織中MnSOD基因的mRNA表達水平研究[J].中國老年學雜志,2006,26(2)：164-165. WANG M C,GUO M F,ZHAO G Q，et al.The study of mRNA expression of MnSOD gene in carcinoma of prostate and innocence prostate hyperplastic tissue[J].ChinaJournalofGerontology，2006，26：164-165.(in Chinese)

[18] HOLDOM M D，LECHENNE B，HAY R J，et al.Production and characterization of recombinant aspergillus fumigatus Cu，Zn superoxide dismutase and its recognition by immune human sera[J].JClinMicrobiol，2000，38(2)：558-562.

[19] NAGATA S.Apoptosis by death factor[J].Cell，1997，88：355-365.

[20] LI H，ZHU H，XU C J，et al.Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis[J].Cell，1998，94：491-501.[21] SORIANO M E，SCORRANO L.Travelling bax and forth from mitochondria to control apoptosis[J].Cell，2011，145(1)：15-17.

[22] ZENG C J,TANG K Y，HE L.Effects of glycerol on apoptotic signaling pathways during boar spermatozoa cryopreservation[J].Cryobiol，2014，68(3)：395-404.

(編輯 程金華)

Preliminary Studies on Apoptosis and Apoptotic Pathways of Frozen Boar Spermatozoa

WANG Xin1,2,3，DAI Jian-jun1,2*，WU Cai-feng1,2,ZHANG Shu-shan1,2，WU Yun-long1,2,3，ZHANG De-fu1,2*

(1.CollegeofFisheriesandLifeScience，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China； 2.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai201106,China；3.DivisionofAnimalGeneticEngineering，ShanghaiMunicipalKeyLaboratoryofAgri-geneticsandBreeding，Shanghai201106，China)

In order to investigate the effects of cryopreservation on boar spermatozoa apoptosis and apoptotic pathway，the flow cytometry was used to detect the apoptosis state and ROS level of boar frozen spermatozoa.ATP content was measured by luminometer，and the mRNA expression level of genes involved in different apoptotic pathways were measured by real-time quantitative RT-PCR method.The results showed that the motility，normal acrosome rate and plasma membrane integrity rate of sperm after freezing were decreased greatly (P<0.05).The TUNEL-positive spermatozoa rate (80.4%) from freezing group were much higher than that of fresh group (9.7%) (P<0.05).The percentage of ROS-positive spermatozoa in freezing group (58.2%) was also obviously higher than that of fresh group (P<0.05).The cryopreservation caused a significant decrease of ATP concentration in freezing group (0.247 μmol·L-1) comparing with fresh group (0.926 μmol·L-1) (P<0.05).qRT-PCR results showed that the relative expression level from promoting apoptosis genes (TNF-α，Fas，Caspase，P53 andBax) were up-regulated，and in which the expression ofFas，P53，TNF-α，Caspase-8 andCaspase-9 increased greatly after cryopreservation (P<0.05).The relative expression level from inhibiting apoptosis genes (BCL-2，BIRC-5，MnSOD，CuZnSODandSURVIVN) were down-regulated，and in which the expression ofBIRC-5，MnSODandSURVIVNdecreased greatly (P<0.05).The results indicated that cryopreservation could lead to boar spermatozoa apoptosis.Not only extrinsic death receptor but also intrinsic mitochondrial signaling pathway might play key roles in mediating spermatozoa apoptosis after cryopreservation.

boar；spermatozoa cryopreservation；apoptosis；apoptotic pathway

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.009

2015-01-05

上海市科委農業成果轉化專項(123919N0700；133919N1700)；國家自然科學基金(31372315)；國家轉基因生物新品種培育科技重大專項(2014ZX08006-005；2009ZX08006-014B)

王 昕 (1988-)，女，山西太原人，碩士，主要從事動物胚胎工程研究，E-mail：winniexin1223@126.com

*通信作者：戴建軍，E-mail：blackman0520@126.com；張德福，E-mail：zhangdefuzdf@163.com

S828.2

A

0366-6964(2015)08-1341-07