基于幾丁質酶基因序列分析鑒定兔源須癬毛癬菌

劉 月，劉彥威，白福娟，劉 娜，劉 伯

(河北工程大學農學院動物醫學重點實驗室，邯鄲 056021)

基于幾丁質酶基因序列分析鑒定兔源須癬毛癬菌

劉 月，劉彥威*，白福娟，劉 娜，劉 伯

(河北工程大學農學院動物醫學重點實驗室，邯鄲 056021)

利用幾丁質酶基因(CHS1)序列分析和形態學方法對兔源須癬毛癬菌分離株(31株)進行鑒定和分型。從患兔采集病料，在沙保弱培養基進行分離培養，觀察菌落和菌絲、孢子的形態及尿素酶、毛發穿孔等生理試驗表現；提取病料和分離株DNA，擴增目的基因，通過序列分析，結合形態學方法對分離株進行鑒定，根據分離株序列同源性差異進行基因分型。結果顯示，分離株的菌落多數為顆粒型和粉末型，占87.09%(27/31)，背面有黃褐色素沉著，有大量葡萄狀小分生孢子、螺旋菌絲、梳狀菌絲及棒狀大分生孢子，尿素酶試驗和毛發穿孔試驗陽性；CHS1序列比對顯示分離菌株與須癬毛癬菌復合體的指間須癬毛癬菌有99.2%～95.4%相似性。根據CHS1序列比對結果，結合分離株的形態學特征，將該菌株鑒定為親動物指間須癬毛癬菌。基于CHS1序列同源性差異，將分離株分成5種基因類型，其中Ⅰ型和Ⅱ型是優勢菌株，占54.84%(17/31)，提示CHS1序列分析可以用于須癬毛癬菌的鑒定和基因分型。

須癬毛癬菌；幾丁質酶基因；序列；鑒定；分型

須癬毛癬菌是引起皮膚真菌病的常見病原真菌，是兔等動物的第一大病原真菌，人的第二大病原真菌[1-2]。隨著養兔業的發展，須癬毛癬菌病的發生有不斷增加的趨勢，這不僅給養兔造成嚴重的經濟損失，更重要的是當兔作為寵物飼養，可以通過與患兔直接和間接接觸傳染人，給公共衛生帶來隱患[3]。傳統皮膚真菌檢查包括病料的直接檢查和分離培養，病料直接顯微檢查可區分皮膚和非皮膚真菌感染，但有時會出現假陰性，因此，通常確診有賴于病原真菌分離培養。由于皮膚真菌生長慢，分離到純化需2～3周[4-5]，這顯然不能滿足臨床的需求，建立快速、準確的鑒定與診斷方法是目前亟待研究的課題。隨著分子生物學技術的發展，通過分子標記序列分析進行真菌鑒別與分類，其結果更加準確可靠[4，6]。

皮膚真菌主要涉及毛癬菌屬(Trichophyton)、小孢子菌屬(Microsporum)和表皮癬菌屬(Epidermophyton)，在臨床上這些皮膚真菌均可引起脫毛、皮膚紅腫及瘙癢等癥狀，且常常是多種皮膚真菌繼發和并發感染。然而，不同皮膚真菌所采取防疫和治療措施是不同的，因此，對皮膚真菌種類確定至關重要[6]。目前，在皮膚真菌系統發育分析和鑒定中，常用的分子標記是內轉錄間(internal transcribed spacer，ITS)區，在國外幾丁質酶基因(chitin synthase genes，CHS)序列系統發育分析已用于皮膚真菌的鑒定[7-8]，而國內，用CHS作分子標記鑒定皮膚真菌報道很少，特別是用于鑒定動物皮膚真菌還未見報道，鑒于此，本試驗直接從患兔采取病料，對皮膚真菌進行分離培養，通過CHS1序列系統發育分析，對分離的皮膚真菌進行鑒定和分型，旨在為皮膚真菌防治提供有價值的資料。

1 材料與方法

1.1 病料的采集

取疑似患皮膚真菌病的兔，病灶用75%酒精消毒，用無菌手術刀在病變和健康皮膚交界處，輕輕刮去皮屑或被毛，放置在滅菌的平皿中。每個兔的病料分成2份，一份用于皮膚真菌的分離培養，一份用于直接檢查。從13個兔場(其中邯鄲6個、保定4個、石家莊3個)共采集病料146份。

1.2 病原真菌分離培養和觀察

將采集的病料(皮屑、被毛)直接涂布在沙保弱培養基(含0.5%氯霉素)，27 ℃培養7 d。挑取菌落接種在土豆瓊脂培養基進行純化培養，27 ℃培養10 d，每天觀察菌落形態、顏色并做記錄。取干凈的載玻片，滴一滴棉蘭染液，用膠帶粘的一面，輕輕按在純化的菌落，放置在滴染液載玻片染色，在顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態。

1.3 生理學試驗

1.3.1 尿素酶試驗 選取分離菌株，接種于尿素培養基(蛋白胨0.1 g、氯化鈉0.5 g、磷酸二氫鉀0.2 g、尿素0.2 g、葡萄糖0.01 g、蒸餾水100 mL、0.2%酚紅0.4 mL)，每日觀察尿素培養基的顏色變化，用紅毛癬菌(校附屬醫院惠贈)作為陰性對照，用本實驗室保藏的須癬毛癬菌株作為陽性對照。

1.3.2 毛發穿孔試驗 用消毒吸管吸取10%酵母浸膏，加入蒸餾水平皿中，每平皿2～3滴，每平皿分別加入數根滅菌的兔毛，接種分離菌于平皿中。27 ℃培養4 d，以后每隔1 d將兔毛用消毒鑷子夾出，分置于載玻片上，加乳酸酚棉蘭染液，鏡下觀察，持續2個月。用紅毛癬菌作為陰性對照，用本實驗室保藏須癬毛癬菌株作為陽性對照。

1.4 DNA提取

DNA提取按試劑盒說明進行。在提取前，對體積較大病料，切成小的碎片，研碎。放在液氮中研磨，以下按試劑盒(真菌基因組DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司)方法進行。對于培養菌株，震蕩培養后，可直接挑取適量的菌絲，其DNA提取方法與病料相同。

1.5 目的基因擴增

從GenBank調取CHS1基因(NW003315086)，采用Primer express 2.0軟件設計一對特異性引物，上游引物為CHSF(5′-GAAGCCTGGAAGAA-GATTGTCG-3′，核苷酸937—959)，下游引物為CHSS (5′-CCTTGATTTCACCGCAGGCAC-3′，核苷酸1 350—1 371)進行真菌CHS1擴增，其片段為435 bp。引物由華大基因合成。

PCR反應體系：Mix 12.5 μL，引物各1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，加ddH2O補足25 μL；PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃50 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min，于4 ℃終止反應，保存備用。取5 μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察結果。

1.6 PCR產物的克隆和測序

PCR反應液回收，pMD18-T載體連接。用熱激法轉化DH5α，用含有50 mg·L-1的氨芐青霉素LB平板(預先涂Xgal和IPTG)篩選陽性克隆并進行雙酶切與驗證。酶切體系(10 μL)組成：Buffer K 1 μL，PstⅠ 0.5 μL，BamHⅠ0.5 μL，含插入片段的質粒DNA 2 μL，ddH2O 6 μL，37 ℃下酶切1 h。序列測定由上海生物工程技術服務公司完成。

1.7 目的片段序列的分析

將待測菌CHS1序列與GenBank中的核酸數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast)進行BLAST比對分析，找出與其相似性最高的菌株。將得到的CHS1序列用ClustalX1.83進行多重序列比對后，用系統發育軟件MEGA4.1，采用最大似然法構建基于CHS1序列分析的系統發育樹，并對所構建的系統發育樹進行自舉分析，估算其內分支的Bootstrap值，進而確定其系統發育關系。

2 結 果

2.1 菌落形態和菌絲、孢子的顯微觀察

在采集146份病料，分離純化31株真菌，分離率為21.23%(31/146)。從病料分離的菌株經純化培養后，根據菌落的形態可分為3種(表1)。1)顆粒型占58.06%(18/31)，菌落呈顆粒狀，表面不平，邊緣不整齊，背面黃褐色(圖1A、B)，在顯微鏡下有呈葡萄狀小分生孢子，大分生孢子為棒狀有5～7分隔，數量較多(圖1E)。2)粉末型占29.04%(9/31)，菌落為粉末狀，表面平滑，背面黃褐色，小分生孢子為圓形或卵圓形，大分生孢子較少。3)絨毛型占12.90%(4/31)，菌落表面有皺褶，邊緣不齊，背面黃褐色，大分生孢子最少，但螺旋菌絲(圖1C)和梳狀菌絲(圖1D)較多。

2.2 生理試驗

尿素酶試驗：分離菌株和陽性對照組菌株，接種在尿素培養基3 d左右就由黃色變成粉紅色(圖2A)，而陰性對照，接種紅色毛癬菌，直到10 d培養基顏色也沒有變紅。

毛發穿孔試驗：將待檢菌接種在培養基上，25 d左右，在分離菌株和陽性對照菌株可觀察到毛發穿孔樣變化，即在毛干有不規則的凹陷及楔狀穿孔(圖2B)，而陰性對照組，紅毛癬菌未發現毛發穿孔現象。

2.3 目的基因擴增結果

利用特異引物CHSF和CHSS，對分離株和直接病料提取的DNA進行CHS1擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，從電泳圖(圖3)可看出，在430 bp處見到擴增條帶，與預測的CHS1序列片段大小范圍一致。

2.4CHS1基因序列分析

利用ClustalX1.83軟件在線構建了分離株(31株)和須癬毛癬菌復合體(Trichophytonmentagrophytescomplex)、小孢子菌屬(Microsporumincurvatum)和表皮癬菌屬(Epidermophytonfloccosum)CHS1基因進化樹，通過序列比對，共分成3個組(圖4)，即Ⅰ組為小孢子菌屬，Ⅱ組為表皮癬菌屬，Ⅲ組為分離株和須癬毛癬菌復合體。不同分離株序列相似性為95.2%～100%，與Microsporumincurvatum、Epidermophytonfloccosum相似性分別為79.4%～88.8%和85.5%～88.6%。分離株與須癬毛癬菌復合體T.interdigitale、A.vanbreuseghemii、A.benhamiae和A.simii相似性分別為99.2%～95.4%、91.6～95.2%%、91.6%～93.9%和89.1%～92.2%，提示分離株CHS1與T.interdigitale相似性(99.2%～95.4%)最高，即分離株為指間須癬毛癬菌(T.interdigitale)。

表1 分離株菌落形態和顯微特征

Table 1 Colony morphology and microscopic features for isolates

表型Phenotype株數StainsNumber分離株Isolates來源Origin小分生孢子Microconidia大分生孢子Macrocondia螺旋菌絲Spiralhypae梳狀菌絲Pectinafehypae顆粒型Granular18B1、B2、B4、B5、B6、B7、B8、B9保定++++++++S3、S4、S6、S7、S10、S11、S12、S14邯鄲G2、A1石家莊粉末型Powder9B3保定+++++++S1、S2、S5、S9、S13邯鄲F2、F3、F1石家莊絨毛型Downy4B10保定+++--/++++++S8邯鄲A2、G1石家莊

A.顆粒狀菌落(正面)；B.顆粒狀菌落(背面)；C.螺旋狀菌絲(400×)；D.梳狀菌絲(400×)；E.大、小分生孢子(400×)A.Granular colony (front)；B.Granular colony (reverse)； C.Spiral hyphae(400×)；D.Pectinafe hyphe(400×)E.Macrospore and microspore (400×)圖1 須癬毛癬菌菌落和菌絲形態Fig.1 Morphology of colony and mycelial in T.mentagrophytes

A.尿素酶試驗；B.兔毛楔狀穿孔(1 000×) A.Urease test；B.Wedge shape perforation in rabbit′s hair (1 000×)圖2 生理試驗Fig.2 Physiological test

M.DNA相對分子質量標準；F1～S11.分離株M.DL2000 DNA marker；F1-S11.Isolates圖3 CHS1擴增結果Fig.3 Result of CHS1 amplification

2.5 分離株CHS1序列比較及分型

從河北兔場共分離須癬毛癬菌31株，其中邯鄲地區14株(S1～S14)、保定地區10株 (B1～B10)和石家莊地區7株(F1～F3、G1～G2、A1～A2)(表2)。經CHS1序列比對，根據相似性差異進行分型，菌株B2、B6、B8、B9、S3、S4、S6、S11、S12、G2相似性為100%，提示這些菌株雖然從不同患兔上分離，但其實完全一致，稱之Ⅰ型株，占32.26%(10/31)，其表型為顆粒型；同樣，菌株F2、F3、S1、S2、S5、S13、B3相似性為100%，稱之Ⅱ型株，其表型為粉末狀，占22.58%(7/31)；菌株S10、S14、S7、B7相似性為100%，稱之Ⅲ型株，其表型為顆粒型，占12.90%(4/31)；菌株A1與B1、菌株B4與B5 、菌株F1與S9相似性分別為100%，稱之Ⅳ型株，其表型主要為顆粒型，亦有粉末型；其他菌株A2、B10、S8、G1均為單一株，稱之為Ⅴ型，其表型為絨毛型(圖5)。

圖4 分離菌株CHS1序列與GenBank序列的系統發育樹Fig.4 A phylogenetic tree of CHS1 sequence from isolates and GenBank

表2 分離株的分型

Table 2 Subtype of isolates

株型Type兔場Rabbitfarm12345678910111213表型Phenotype百分比/%PercentageⅠ型TypeⅠB2B6B8、B9S3、S4S6S11S12G2顆粒型Granular32．26(10/31)Ⅱ型TypeⅡB3S1、S2S5S13F2、F3粉末型Powder22．58(7/31)Ⅲ型TypeⅢB7S7S10S14顆粒型Granular12．90(4/31)Ⅳ型TypeⅣB1B4B5S9A1F1顆粒/粉末型Granular/Powder19．35(6/31)Ⅴ型TypeⅤB10S8A2G1絨毛型Downy12．90(4/31)

圖5 分離株CHS1系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of CHS1 sequence in isolates

2.6 病料PCR和CHS1序列分析

從分離須癬毛癬菌陽性病料中，挑選10份病料直接提取DNA，進行CHS1擴增，經瓊脂糖電泳后，其片段大小與分離株一致，通過序列測定和比對，與相應的分離株的序列沒有差異。

3 討 論

3.1 分離株鑒定為親動物指間須癬毛癬菌

兔皮膚真菌病涉及毛癬菌屬、小孢子菌屬和表皮癬菌屬，共有30余種病原真菌。皮膚真菌不同所采取的預防和控制措施不同，所用治療藥物也有差異，因此，對皮膚真菌進行種和菌株水平的鑒定至關重要[7，9]。本試驗選用CHS1作為靶基因，經過序列分析并與相應GenBank基因序列比對，根據同源性不同，很清晰把這三個屬皮膚真菌分開。且發現分離株與須癬毛癬菌同源性最高，因此，可以鑒定該皮膚真菌歸須癬毛癬菌屬。

須癬毛癬菌長久以來被視為一個單一的菌種，但隨著交配試驗和分子生物學的研究，學者們發現須癬毛癬菌應該被視為一個菌種的復合體，所包括的菌種分屬于3種不同有性型菌屬，分別是本海姆節皮菌(A.benhamiae)、萬博節皮菌(A.vanbreuseghemii)和猴節皮菌(A.simii)，并包含有不同親宿主性的無性型菌種(如指間須癬毛癬菌、須癬毛癬菌顆粒變種等)[1,6]。采用CHS1序列比對，按相似性不同，本試驗發現，與須癬毛癬菌復合體中其他菌株相比，分離株與指間須癬毛癬菌相似性最高(99.2%～95.4%)，因此，該皮膚真菌應屬于須癬毛癬菌復合體的指間須癬毛癬菌。這與本實驗室用rDNA ITS作為靶基因比對的結果一致(未發表資料)。P.L.Sun等對兔源須癬毛癬菌復合體的8株菌進行了分子系統分析，這些分離株被鑒定為指間須癬毛癬菌[3]，這與本試驗結果一致。但Y.Gr?ser等則認為本海姆節皮菌是兔主要的病原真菌[10]，M.Kawasaki等報道用交配試驗從兔分離到本海姆節皮菌[11]，提示不同地區兔須癬毛癬菌復合體種類可能存在差異。

本試驗發現在沙保弱培養基上，分離株菌落多數為顆粒型和粉末型，能產生黃褐色素，且隨著培養時間的延長，色素增多，顏色加深。尿素酶試驗陽性，提示該分離株可分解尿素，產生堿性物質，隨著pH升高，使培養基酚酞由無色轉變為紅色，致使整個培養基呈粉紅色。在毛發穿孔試驗中，由于分離株能產生分解角質蛋白的酶，因此，這些菌株可以利用角化毛發進行生長繁殖，可在毛干或毛髓中看到菌絲生長，正是這些菌絲生長，破壞了毛干形態結構，使之出現“楔狀”損傷，即毛發穿孔試驗陽性。這些均符合須癬毛癬菌的特征[1]，從生理學和菌落形態進一步支持了CHS1序列比對的鑒定結果。

指間須癬毛癬菌根據宿主不同分為親人和親動物兩種[12]。本試驗發現分離株菌落為顆粒狀和粉末狀，在顯微鏡下較多的大分生孢子和螺旋菌絲，這些均為親動物形態特征，這些菌株均由兔分離而來，所以該分離株應該為親動物指間須癬毛癬菌。

3.2 表型顆粒型、粉末型和基因Ⅰ型、Ⅱ型是主要流行株

對須癬毛癬菌菌落形態的分型已有報道，李慶祥等依據菌落的形態，菌絲及大小分生孢子的特征，尿素酶試驗和體外毛發穿孔試驗，將人源的須癬毛癬菌表型分為羊毛狀、緊密狀、絨毛狀、粉末狀和顆粒狀，以羊毛狀、緊密狀、絨毛狀居多(占72.22%，26/36)，且發現菌株的表型與致病性及耐藥性有關[13]。本試驗分離的31株菌，僅發現顆粒狀、粉末狀和絨毛狀3種菌落類型，且以顆粒狀和粉末狀居多，約占87.09%(27/31)。P.L.Sun等報道兔源指間須癬毛癬菌的表型以顆粒狀為主[3]，而E.Fréalle等報道以粉末狀為主[14]，人源與兔源分離株菌落表型的差異，可能與宿主不同有關。

E.Fréalle等基于含錳超氧化歧化酶(MnSOD)基因序列比對將41株須癬毛癬菌分成5種基因型[14]，而B.Ninet等用28S rDNA多態位點將67株須癬毛癬菌分成3種基因型[15]，I.Drira等用可變數量串聯重復(VNTR)序列為標記將92株指間須癬毛癬菌分成3群[2]。本試驗根據CHS1序列差異，將分離指間須癬毛癬菌31株分成5個基因型，其中Ⅰ型(表型為顆粒型)和Ⅱ型(表型為粉末型)從3個地區均能分離到，提示這些基因型的菌株地理分別比較廣；另外，這兩種類型的菌株，約占流行株54.84%(32.26%+22.58%)，是本地區流行優勢菌株，這與表型中以顆粒型和粉末型居多的結果一致。這些均為針對基因型和表型，采取有效措施預防和治療須癬毛癬菌病提供了有價值的資料。但李金海等用隨機擴增多態性DNA的方法，分析了不同表型人源須癬毛癬菌，擴增后其基因型沒有差異[16]。方法不同，須癬毛癬菌基因分型結果不一樣，導致這種差異的原因可能與菌株的組成以及所用方法的敏感性和選用的標記分子有關。

3.3 病料可直接用于基因序列分析

有關須癬毛癬菌鑒定和診斷，多數報道是從分離培養須癬毛癬菌中提取DNA，然后進行分子生物學的研究，眾所周知，須癬毛癬菌生長緩慢，從分離到純化一般需要2～3周的時間，因此，不利于該病的早鑒定和早診斷，鑒于此，本試驗直接從病料提取DNA進行目的基因擴增，經基因比對，與培養菌株沒有差異，提示對于須癬毛癬菌的鑒定和診斷可直接采集病料，減少培養環節，明顯縮短鑒定時間，為該病的及時診斷奠定基礎。

4 結 論

用幾丁質酶基因特異引物，擴增目的片段，通過序列比對，根據序列相似性差異，可對常見3個屬的皮膚真菌進行鑒定，也能將同種，而宿主不同形成須癬毛癬菌復合體進行區分。基因比對方法敏感、穩定，不易受培養條件的影響。用菌落形態、菌絲顯微結構及生理生化特征鑒定方法，雖簡單、直觀，但易受培養條件的干擾。因此，理想方法是分子生物學與形態學相結合。用基因比對結合形態學方法，將分離株鑒定為親動物指間須癬毛癬，兔場菌感染率為21.23%。根據菌落的形態特征將分離31株須癬毛癬菌分為顆粒型、粉末型和絨毛型三種表型，其中以顆粒型和粉末型為主。基因比對方法將分離株分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ五種基因型，基因Ⅰ型、Ⅱ型是主要流行株。

[1] 陳柏教，孫 毅，胡小平，等.須癬毛癬菌的形態學及分子生物學鑒定[J].中國真菌學雜志，2010，5(6):321-326. CHEN B J，SUN Y，HU X P，et al.Morphology and molecular biological identification ofTrichophytonmentagrophytes[J].ChineseJournalofMycology，2010，5(6):321-326.(in Chinese)

[2] DRIRA I，HADRICH I，NEJI S，et al.Highly discriminatory variable-number tandem-repeat markers for genotyping ofTrichophytoninterdigitalestrains[J].JClinMicrobiol, 2014，52(9):3290-3296.

[3] SUN P L，HSIEH H M，JU Y M，et al.Molecular characterization of dermatophytes of theTrichophytonmentagrophytescomplex found in Taiwan with emphasis on their correlation with clinical observations[J].BrJDermatol，2010，163(6):1312-1318.

[4] DHIB I，FATHALLAH A，CHARFEDDINE I B,et al.Evaluation of Chitine synthase (CHS1) polymerase chain reaction assay in diagnosis of dermatophyte onychomycosis[J].JMycolMed，2012，22(3):249-255.

[5] CALDERARO A，MOTTA F，MONTECCHINI S, et al. Identification of dermatophyte species after implementation of the in-house MALDI-TOF MS database[J].IntJMolSci，2014，15(9):16012-16024.

[6] 劉彥威，柳煥章，劉建釵，等.河北兔場皮膚病原真菌rDNA-ITS序列分析[J].中國獸醫學報，2013，33(9):1383-1386. LIU Y W，LIU H Z，LIU J C，et al.Sequences analysis of rDNA ITS of rabbit dermatophytes in Hebei province[J].ChineseJournalofVeterinaryScience, 2013，33(9):1383-1386.(in Chinese)

[7] CAFARCHIA C，IATTA R，LATROFA M S，et al.Molecular epidemiology phylogeny and evolution of dermatophytes[J].InfectGenetEvol, 2013，20:336-351.

[8] CAFARCHIA C，WEIGL S，FIGUEREDO L A，et al.Molecular identification and phylogenesis of dermatophytes isolated from rabbit farms and rabbit farm workers[J].VetMicrobiol，2012，154(3-4):395-402.

[9] NENOFF P，KRüGER C，GINTER-HANSELMAYER G，et al.Mycology-an update.Part 1：Dermatomycoses：causative agents，epidemiology and pathogenesis[J].JDtschDermatolGes，2014，12(3):188-209.

[11] KAWASAKI M，ASO M，INOUE T,et al.Two cases of tinea corporis by infection from a rabbit withArthrodermabenhamiae[J].NihonIshinkinGakkaiZasshi，2000，41(4)：263-267.

[12] NENOFF P，UHRLAB S，KRüGER C, et al.Trichophytonspecies ofArthrodermabenhamiae- a new infectious agent in dermatology[J].JDtschDermatolGes，2014，12(7)：571-581.

[13] 李慶祥，楊國玲，安利佳.須癬毛癬菌表型的研究[J].中國麻風皮膚病雜志，2007，23(3):209-210. LI Q X，YANG G L，AN L J.Study on the phenotyping ofTrichophytonmentagrophytes[J].ChinaJournalofLeprosyandSkinDiseases，2007，23(3):209-210.(in Chinese)

[14] FRéALLE E，RODRIGUE M，GANTOIS N，et al.Phylogenetic analysis ofTrichophytonmentagrophyteshuman and animal isolates based on MnSOD and ITS sequence comparison[J].Microbiology，2007，153(10):3466-3477.

[15] NINET B，JAN I，BONTEMS O，et al.Identification of dermatophyte species by 28S ribosomal DNA sequencing with a commercial kit[J].JClinMicrobiol，2003，41(2):826-830.

[16] 李金海，劉玉美，宮 英，等.常見皮膚癬菌的基因分型[J].青島大學醫學院學報，2007，43(3)：269-270，272. LI J H，LIU Y M，GONG Y，et al.Establishment of the genotyping method for common derma tophytes[J].ActaAcademiaeMedicinaeQingdaoUniversitatis，2007，43(3)：269-270，272.(in Chinese)

(編輯 白永平)

Identification ofTrichophytonmentagrophytesin Rabbit based on the Chitinase Gene Sequence Analysis

LIU Yue，LIU Yan-wei*，BAI Fu-juan，LIU Na，LIU Bo

(KeyLaboratoryofAnimalMedicine,AgriculturalCollegeofHebeiUniversityofEngineering，Handan056021,China)

It was conducted to identify the gene type of 31Trichophytonmentagrophytesisolated from rabbits.Samples were collected from infected rabbits for cultivation experiments on Sabouraud′s medium.Isolates were identified by morphology，urease test，hair perforation test and DNA analysis，and then subjected to phenotyping analysis byCHS1 gene sequencing.Results showed that 87.09% (27/31) of the colonies were granular- and powder-like with yellow-brown pigmentation deposition.Numerous grape-like microconidia，spiral hyphae，pectinafe mycelium and club-shaped macroconidia were presented in the culture.Urease test and hair perforation test were positive.TheCHS1 sequences of the isolates showed 99.2%-95.4% homology withTrichophytoninterdigitale.The results indicate that the isolates obtained in the present study are most likely zoophilicTrichophytoninterdigitale.Based on theCHS1 gene variations in sequences，the isolates were divided into 5 genotypes.The type Ⅰ and type Ⅱ were the dominant genotypes，which accounted for 54.84% (17/31) of the isolates.These results suggest that analysis ofCHS1 sequences is useful for identification and typing ofTrichophytonmentagrophytes.

Trichophyton mentagrophytes；chitinasegene；sequence；identification；subtype

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.018

2014-12-19

河北省教育廳重點項目(Z02014048)；邯鄲市科技局資助項目(1422101047-3)

劉 月(1990-)，男，河北保定人，碩士，主要從事病原真菌的研究，Tel:0310-8573034，E-mail:812094491@qq.com

*通信作者：劉彥威，E-mail:Liuyw.edu@126.com

S852.66

A

0366-6964(2015)08-1417-08