紫外線照射對SD大鼠晶狀體抗氧化酶活性的影響

趙學發(fā)，楊名慧，葛正龍

（遵義醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，貴州遵義563099）

紫外線照射對SD大鼠晶狀體抗氧化酶活性的影響

趙學發(fā)，楊名慧，葛正龍

（遵義醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，貴州遵義563099）

目的以紫外線照射SD大鼠為研究模型，觀察紫外線對晶狀體中抗氧化酶[（超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）]活性的影響。方法將30只6周齡SD大鼠隨機分為五組，每組6只，對照組不做處理，其余四組實驗組腹腔注射水合氯醛（10%，0.35 mL/100 g）麻醉大鼠，紫外燈正對大鼠眼球照射15 min，照射強度1.0×103μW/cm2。分別于紫外線照射后1、3、5、7 d頸椎脫臼處死SD大鼠，立即取出晶狀體，觀察晶狀體是否渾濁，并拍照記錄；比色法檢測晶狀體中SOD、GSH-Px、CAT活性及超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）含量。結(jié)果紫外線照射后晶狀體的渾濁程度隨時間延長而逐漸加重；晶狀體中SOD活性較對照組顯著降低，而O2-含量顯著升高，GSH-Px活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；紫外線照射后3、5、7 d晶狀體中CAT活性較對照組顯著降低，而H2O2含量較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；紫外線照射后晶狀體中MDA含量較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)論紫外線誘導白內(nèi)障的發(fā)生與晶狀體中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性降低有關(guān)。

晶體； 紫外線； 白內(nèi)障； 超氧化物歧化酶； 谷胱甘肽過氧化酶； 過氧化氫酶； 大鼠，Sprague-Dawley

白內(nèi)障（cataract）作為首位致盲疾病，其導致的視力障礙給白內(nèi)障患者的生活質(zhì)量帶來極大的影響。調(diào)查研究顯示，高海拔低緯度地區(qū)白內(nèi)障發(fā)病率明顯高于低海拔高緯度地區(qū)（如西藏1.04%、廣東0.69%、而黑龍江0.26%）[1]。由于高海拔地區(qū)空氣稀薄，對紫外線的濾過作用較弱，而低緯度地區(qū)日照時間長，所以該地區(qū)紫外線照射較強[2]。實驗研究證實，紫外線照射與白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]，尤其中波紫外線（UV-B，波長280～320 nm）是白內(nèi)障發(fā)生的重要危險因素之一，其對晶狀體的損傷作用最強。紫外線照射通過產(chǎn)生大量的活性氧化簇（ROS），從而氧化損傷DNA[5-6]及晶狀體上皮細胞、干擾新陳代謝，導致晶狀體中可溶性蛋白減少，不溶性蛋白增加，晶狀體發(fā)生渾濁。據(jù)WHO估計，每年大約有1 600萬白內(nèi)障新增患者，其中20%左右與過度紫外線照射有關(guān)[7]。研究表明，晶狀體渾濁與紫外線誘導產(chǎn)生的氧自由基有關(guān)，而晶狀體中存在多種抗氧

化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）等，這些酶能夠及時清除晶狀體中的活性氧，擔負著晶狀體的生長、分化及損傷修復，對整個晶狀體的透明性和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性方面具有重要的保護作用[2]。本實驗通過紫外線照射SD大鼠，觀察紫外線照射對晶狀體中抗氧化酶（SOD、GSHPx、CAT）活性的影響，為白內(nèi)障的防治研究提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級6周齡SD大鼠，雌雄不拘（購于第三軍醫(yī)大學，合格證號：SCXK（渝）2012-0005），722S型可見分光光度計（上海菁華科技），酶標儀（美國Bio-Rad公司），紫外線照射燈（飛利浦），SOD、GSH-Px、CAT活性測定試劑盒及超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），水合氯醛（分析純）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 參照文獻[8]，將30只6周齡SD大鼠隨機分為五組，每組6只，其中一組為對照組，不做任何處理；其余四組為實驗組，以復方托吡卡胺滴眼液對雙側(cè)眼球進行擴瞳，5min后，腹腔注射水合氯醛（10%，0.35 mL/100 g）麻醉大鼠，以干凈的醫(yī)用棉簽擦去殘留在角膜上的滴眼液。紫外燈（300～320 nm）分別左右正對SD大鼠眼球進行照射，照射強度1.0×103μW/cm2，照射時間15 min，累計輻射劑量9 kJ/m2。分別于紫外線照射后1、3、5、7 d頸椎脫臼處死SD大鼠，立即取出眼球。

1.2.2 觀察晶狀體的渾濁程度 小心解剖眼球，取出晶狀體置于預冷的生理鹽水中漂洗，肉眼觀察紫外線照射后晶狀體是否發(fā)生渾濁，并用數(shù)碼相機拍照記錄。

1.2.3 晶狀體中SOD、GSH-Px、CAT活性測定 晶狀體稱質(zhì)量，置于玻璃勻漿器中，加入預冷的生理鹽水，制備10%的蛋白勻漿，4℃2 500 r/min離心10 min，取上清液待用。晶狀體中SOD、GSH-Px、CAT活性測定根據(jù)試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 晶狀體中O2-、H2O2、MDA含量測定 樣品處理同1.2.3，晶狀體中O2-、H2O2、MDA含量測定根據(jù)試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 紫外線照射后晶狀體透明性的變化 紫外線照射后1 d晶狀體的透明性未發(fā)現(xiàn)明顯改變，而隨著時間的推移，晶狀體的透明性發(fā)生變化，第3天發(fā)現(xiàn)輕度渾濁，而第7天晶狀體呈霧狀渾濁。見圖1。

2.2 紫外線照射后晶狀體中SOD活性及O2-含量變化 紫外線照射后晶狀體中SOD活性降低，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2A。而晶狀體中O2-含量隨時間延長逐漸升高，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2B。

圖1 紫外線照射后晶狀體透明性的變化

圖2 紫外線照射后晶狀體中SOD活性及O2-含量變化

2.3 紫外線照射后晶狀體中GSH-Px活性變化 紫外線照射后晶狀體中GSH-Px活性隨時間延長逐漸降低，且與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3。

2.4 紫外線照射后晶狀體中CAT活性變化 紫外線照射后1 d晶狀體中CAT活性降低，但與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而紫外線照射后3、5、7 d晶狀體中CAT活性較對照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖4。

圖3 紫外線照射后晶狀體中GSH-Px活性變化

圖4 紫外線照射后晶狀體中CAT活性變化

2.5 紫外線照射后晶狀體中H2O2含量變化 紫外線照射后晶狀體中H2O2含量隨時間的延長逐漸升高，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖5。

圖5 紫外線照射后晶狀體中H2O2含量變化

2.6 紫外線照射后晶狀體中MDA含量變化 隨著時間的延長，晶狀體中MDA含量逐漸升高，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖6。

圖6 紫外線照射后晶狀體中MDA含量變化

3 討 論

日光中的紫外線按其波長大小可分為短波紫外線（UV-C，波長200～280 nm）、UV-B（波長 280～320 nm）、長波紫外線（UV-A，波長320～400 nm）。其中UV-C主要被臭氧層吸收，而部分UV-B和UV-A主要被晶狀體所吸收。由于對晶狀體損傷作用最強的紫外線為UV-B，而調(diào)查研究顯示，若臭氧層總量減少1%，會導致到達地球表面的UV-B增加1.5%～2.0%，因此本實驗采用波長為300～320 nm紫外線為干擾因素，研究晶狀體中抗氧化酶活性的改變更有意義。有研究報道，紫外線可誘導白內(nèi)障的形成，且紫外線的輻射劑量與白內(nèi)障的發(fā)生呈正相關(guān)[9]。而關(guān)于紫外線照射誘導白內(nèi)障發(fā)生的機制尚不十分清楚，目前研究認為，晶狀體氧化損傷是白內(nèi)障發(fā)生的重要因素，同時也是紫外線誘導白內(nèi)障形成的主要機制。體外研究表明，紫外線照射可導致晶狀體上皮細胞中抗氧化酶活性降低[10]，但體外研究不能更好地反映出晶狀體的內(nèi)環(huán)境。因此，本實驗注重體內(nèi)研究紫外線對SOD、GSH-Px、CAT活性的影響，探討其在晶狀體中所具有的作用。

晶狀體中存在一系列的抗氧化防御系統(tǒng)，包括酶類和非酶類抗氧化物質(zhì)，而晶狀體中SOD、GSH-Px、CAT作為主要的酶類抗氧化物質(zhì)，可保護晶狀體免遭氧化損傷，以維持晶狀體的透明性。其中SOD可將氧化損傷性較強的O2-分解為H2O2；而GSH-Px、CAT又能分解SOD催化產(chǎn)生的H2O2和其他來源的H2O2，從而達到抗氧化的作用。因此，晶狀體中SOD、GSH-Px、CAT作為抗氧化損傷的第一道防線，其催化活性對晶狀體具有重要的保護作用。任何能夠影響晶狀體中SOD、GSH-Px、CAT催化活性的因素均可能導致白內(nèi)障的發(fā)生。

研究表明，當紫外線照射晶狀體時，光解晶狀體上皮細胞內(nèi)的色氨酸產(chǎn)生3-羥基犬尿氨酸和甲酰L-犬尿氨酸[11]，并作為內(nèi)源性光敏劑，產(chǎn)生大量的氧自由基（如O2-、H2O2等），直接對晶狀體中起屏障作用的抗氧化酶產(chǎn)生氧化損傷、破壞酶的催化功能[10]。此外，氧自由基可導致晶狀體蛋白氧化損傷，在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)內(nèi)部形成二硫鍵，使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，誘導白內(nèi)障的發(fā)生[12]；也可氧化損傷晶狀體上皮細胞線粒體膜，導致線粒體膜內(nèi)外發(fā)生一系列生化改變，如細胞色素C的釋放、caspase蛋白酶家族的活化，從而使晶狀體上皮細胞發(fā)生凋亡[13]。晶狀體上皮細胞凋亡是白內(nèi)障發(fā)生的早期事件，也是紫外線誘導白內(nèi)障形成的細胞學基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，紫外線照射后大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性降低，導致晶狀體中O2-、H2O2含量升高，提示紫外線照射氧化損傷晶狀體中SOD、GSH-Px、CAT的催化功能，導致晶狀體中由紫外線照射產(chǎn)生的O2-、H2O2不能及時被清除。晶狀體內(nèi)O2-、H2O2的大量積聚可損害細胞的膜系統(tǒng)，如自由基與細胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，最后形成脂質(zhì)過氧化物，抑制Na+-K+-ATP酶活性，導致晶狀體上皮細胞發(fā)生凋亡[14]。MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量是衡量氧化損傷的重要指標。本實驗結(jié)果顯示，紫外線照射后晶狀體中MDA含量顯著升高，提示晶狀體中氧化損傷程度加劇，導致晶狀體發(fā)生渾濁。因此，本研究認為，紫外線照射通過降低晶狀體中SOD、GSH-Px、CAT活性，不能及時清除氧自由基，導致晶狀體氧化損傷，是白內(nèi)障發(fā)生的一個重要機制。

綜上所述，紫外線照射可直接氧化損傷晶狀體中抗氧化酶活性，導致氧自由基的大量積累，氧化損傷晶狀體，導致白內(nèi)障的發(fā)生。因此，應(yīng)用抗氧化物質(zhì)來預防白內(nèi)障的發(fā)生是否可行，還需進一步研究。

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The effect of ultraviolet radiation on antioxidant enzymes activities in rat lens

Zhao Xuefa，Yang Minghui，Ge Zhenglong
（Department of Biochemistry and Molecular Biology，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563099，China）

ObjectiveTo observe the effect of ultraviolet radiation on antioxidant enzymes activities（SOD，GSH-Px，CAT）with the research model of SD rats under the ultraviolet irradiation.MethodsA total of 30 SD rats aged 6 months were randomly divided into 5 groups，6 rats in each group，including one as the control group without any disposal and four as the experimental groups，who were injected 10%chloral hydrate（0.35 mL/100 g）abdominally for anesthesia.Using UV lamps radiated SD rats′eyes for 15 minutes after pupillary dilation with the exposure intensity being 1.0×103μW/cm2，the exposed animals were put to death by cervical dislocation on the first，third，fifth and seventh day respectively after exposure and then the lenses from the rats were extracted as soon as possible.It was observed whether the lenses were muddy or not，taking pictures to be recorded.The colorimetry was used to determine the activities of superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px），catalase（CAT）and the content of O2-，H2O2，malondialdehyde（MDA）.ResultsAfter exposure under ultraviolet radiation，the longer the exposure period was，the heavier the muddy degree become.It was decreased in SOD activities of the lenses than that of the control group while increased in O2-content significantly，and declined distinctively in GSH-Px activities.The difference had statistical significance（P＜0.01）.On the third，fifth and seventh day，the CAT activities in the lenses was lower compared with the control group while the H2O2content was significantly increased compared with the control group.The difference had statistical significance（P＜0.01）.The MDA content in the lenses after ultraviolet exposure，The difference had statistical significance（P＜0.01）. Conclusion The occurrence of UVB-induced cataract plays an important role in SOD，GSH-Px，CAT in the lenses.

Lens，crystalline； Ultraviolet rays； Cataract； Superoxide dismutase； Glutathione peroxidase；Catalase； Rats，sprague-dawley

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.08.004

：A

：1009-5519（2015）08-1131-03

2015-01-14）

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項基金資助項目（黔省專合字[2009]47號）。

趙學發(fā)（1986-），男，貴州遵義人，在讀碩士研究生，主要從事生物技術(shù)應(yīng)用方面的研究；E-mail：996775976@qq.com。

葛正龍（E-mail：zlongge@hotmail.com）。